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目的:
(1)观察卡波氏肉瘤相关病毒 (Kaposi’s sarcoma-associated herpes virus,KSHV) 感染对Jurkat细胞内几条主要的抗艾滋病基因(RANTES、APOBEC3G、APOBEC3F、MX1、MX2)表达水平的影响。明确KSHV感染是否具有激活宿主免疫基因表达的功能。
(2)进一步研究KSHV编码的K6,K4,K4.1基因对RANTES、APOBEC3G、APOBEC3F、MX1、MX2基因表达水平的影响。
方法:
(1)用佛波酯(TPA)(20ng/ml)刺激BCBL-1细胞24小时,提取KSHV病毒滤液。然后用含KSHV感染Jurkat细胞。24小时后,分别在感染后第3、5天收集细胞,提取细胞总RNA,通过实时定量PCR (Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction,RQ-PCR)检测分析相关基因的表达情况。
(2)通过克隆的方法构建K6,K4,K4.1三条基因的真核表达载体,采用电转或脂质体转染法将重组载体转入Jurkat,Hela,L929细胞中。36小时后收集细胞提取总RNA,通过qRT-PCR技术检测细胞内几条主要的抗HIV作用的基因表达水平。
结果:
(1) KSHV感染可以上调Jurkat细胞内RANTES、APOBEC3G、APOBEC3F、MX1、MX2基因表达,在感染后第三天表达水平分别上调了123、3.12、1.18、2.75、4.35倍;第五天分别上调了11.91、0.86、0.73、2.72、2.22倍。
(2)通过对重组载体组与空载体组细胞内抗HIV基因表达分析,结果显示KSHV的K6、K4、K4.1 均能够使Jurkat、Hela、L929细胞中抗HIV基因表达上调。
K6基因使Jurkat细胞RANTES、A3G、A3F、MX1分别上调7.37、1.58、2.42、2.06倍;使Hela细胞中MX1、MX2分别上调3.42、2.42倍;使L929细胞中RANTES、A3G、A3F、MX1、MX2分别上调4.94、1.59、2.88、1.84、2.06倍。
K4基因使Jurkat细胞中RANTES、A3G、A3F、MX1、MX2分别上调2.55、2.41、3.09、2.02、2.67倍;使Hela细胞中MX1、MX2分别上调、4.16、71.84倍;使L929细胞中RANTES、A3G、A3F、MX1、MX2分别上调8.22、1.65、6.99、3.67、6.02倍。
K4.1基因使Jurkat细胞中A3G、A3F、MX1分别上调1.51、1.77、1.64倍;使Hela细胞中MX1、MX2上调4.11,4.84;使L929细胞中RANTES、A3G、A3F,MX2分别上调2.73、1.80、7.09、6.87倍。
结论:
(1)KSHV感染可以激活Jurkat细胞抗HIV相关基因的表达。
(2)KSHV的K6,K4,K4.1基因在激活Jurkat,Hela,L929细胞内抗HIV相关基因的表达发挥了重要作用。