论文部分内容阅读
目的:近年来,我国福建、江浙和广东等地发生并流行一种新的严重危害养鸭业的番鸭“花肝病”,造成了巨大的经济损失;引起国内兽医界许多专家学者们的广泛关注和探讨性研究,从发表的论文看,其病原或病因的结果不尽一致。福建农林大学动物保健所吴宝成教授从本省患“花肝病”番鸭脏器中得到的病原分离物,经致病性、电镜及血清学等方法鉴定,首次证实番鸭“花肝病”的病原为番鸭呼肠孤病毒。由于国内番鸭呼肠孤病毒分离株与已有报道的禽源毒株在致病性、组织嗜性上存在差异,因此本试验以S1133为参考株,对国内分离自番鸭的呼肠孤病毒株（DRV-YH）进行病毒纯化及其核酸与结构蛋白分析,从分子水平上对该国内番鸭分离株进行进一步鉴定并比较两者是否存在差异。 方法:国内番鸭分离株（DRV-YH）首先利用固体培养基在番鸭成纤维细胞（DEF）上克隆纯化3次,然后用199培养液在鸡成纤维细胞（CEF）上增殖,收获的细胞培养物经3次冻融;采取差速离心、超速离心、非线性蔗糖密度梯度离心和脱糖处理相结合的方法进行提纯;不同梯度区带的蛋白提取物经电镜观察、毒价(TCID50)和含量（D值）测定得到病毒纯化物;最后对病毒纯化物进行琼脂糖核酸电泳和SDS-PAGE蛋白电泳分析。 结果:国内番鸭分离株（DRV-YH）经三次克隆得到病毒克隆株（记为DRV-YJL）。两种病毒株（DRV-YJL和S1133）经增殖培养收获的病毒悬液TCID50值分别达106.5/0.02ml和108.0/0.02ml。经纯化后的DRV-YJL和S1133在20-35%和35-50%区带上分别得到两种蛋白提取物,其中在35-50%区带上的蛋白提取物中观察到大量球形、无囊膜、双层衣壳,直径约为60—80nm病毒粒子。同时测得DRV-YJL和S1133在35-50%区带上的纯化病毒毒价(TCID50)分别为108.8/0.02ml和1010./0.02ml,蛋白含量分别为5.2mg/ml和5.7mg/ml。国内番鸭分离株经核酸电泳分析得到10条RNA带,分列呈“334”形式的三组,它与参考株S1133比较,两者在核酸电泳迁移率上除M3基因外无明显差异;经SDS-PAGE蛋白电泳分析得到分子质量分别为149.0、129.0、111.0、79.0、75.0、50.0、42.0、39.0、37.0、35.9、32.0、29.0ku的12条蛋白带,其中5个蛋白的分子质量与参考株S1133相近。 结论:该国内番鸭分离株具有禽类呼肠孤病毒核酸和蛋白电泳图谱的共同特征。