ITU对HT-29细胞增殖抑制作用及DLC-1基因的影响

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目的:探讨5-碘代杀结核菌素(5-iodotubercidin,ITU)对人结肠癌细胞HT-29株增殖凋亡的影响及DLC-1基因表达的影响。  方法:不同浓度(0.1、0.5、1、2、4、6、8、10μmol/L)的ITU作用于HT-29细胞48小时,用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测HT-29细胞的增殖活性;ITU(0、2、4、6μmol/L)作用于HT-29细胞48小时,流式细胞术(Flow cytometry,FCM)检测其凋亡率;ITU(0、2、4、6μmol/L)作用于HT-29细胞48小时,用亚硫酸氢盐克隆测序法(BSP)检测DLC-1基因启动子区CpG岛甲基化情况;同上的处理细胞的方法,用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测肝癌缺失基因-1(deleted in liver cancer-1 DLC-1)mRNA的表达情况;应用蛋白印迹法(Western blot)检测DLC-1基因蛋白表达情况。  结果:(1).ITU可明显抑制HT-29细胞活力,在一定范围内随着药物浓度增加抑制细胞活力的作用越强(P<0.05),以6μmol/L组对HT-29细胞影响最大,计算得IC50=5.92±0.62μmol/L;(2).分别予以0、2、4、6μmol/L的ITU作用于HT-29细胞后应用FCM检测各组检测率分别为:(9.56±2.21)%、(22.18±3.16)%、(34.23±3.16)%、(40.5±3.16)%,结果显示随着ITU浓度增加,对HT-29细胞的促凋亡作用越强。(3).经0、2、4、6μmol/L ITU处理后DLC-1基因启动子区CpG岛甲基化率分别为:91.67%、75%、61.67%、43.33%,结果显示ITU可以引起DLC-1基因启动子区甲基化程度降低。(4).在HT-29细胞中可检测到少量DLC-1 mRNA和蛋白的表达;相同条件处理细胞后检测显示DLC-1基因mRNA和蛋白的表达增加,并随浓度增长mRNA及蛋白表达随之增加。  结论:ITU可抑制人结肠癌HT-29细胞增殖,促进HT-29细胞凋亡,而这种抑制增殖作用可能和ITU可降低DLC-1基因启动子区甲基化水平而诱导DLC-1基因上调有关。
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