【摘 要】
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目的:基于大鼠椎间盘退变模型,观察鹿茸多肽对椎间盘髓核细胞自噬的影响,探讨鹿茸多肽基于AKT-mTOR信号通路保护椎间盘,延缓椎间盘退变的作用机制,分析中医“制则生化”理论在鹿茸多肽应用中的指导作用。材料与方法:购入1月龄的60只健康SD大鼠。随机分为空白（normal）、对照（control）、鹿茸多肽（PAP）、雷帕霉素（Rap）、鹿茸多肽+雷帕霉素（PAP+Rap）5组,每组12只,对照组、
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目的:基于大鼠椎间盘退变模型,观察鹿茸多肽对椎间盘髓核细胞自噬的影响,探讨鹿茸多肽基于AKT-mTOR信号通路保护椎间盘,延缓椎间盘退变的作用机制,分析中医“制则生化”理论在鹿茸多肽应用中的指导作用。材料与方法:购入1月龄的60只健康SD大鼠。随机分为空白（normal）、对照（control）、鹿茸多肽（PAP）、雷帕霉素（Rap）、鹿茸多肽+雷帕霉素（PAP+Rap）5组,每组12只,对照组、鹿茸多肽组、雷帕霉素组、鹿茸多肽+雷帕霉素组采用双前肢去势法造模,随后每周增加食水高度饲养。造模8周后,空白组不做任何处置,对照组用生理盐水灌胃,鹿茸多肽组用浓度为4.5mg/ml的鹿茸多肽进行灌胃,雷帕霉素组用浓度为0.2mg/ml的雷帕霉素腹腔注射,鹿茸多肽+雷帕霉素组用浓度为0.2mg/ml的雷帕霉素腹腔注射联合浓度为4.5mg/ml的鹿茸多肽进行灌胃,各组均给药8周。给药结束后,5组中,半数样本取L5/6椎间盘及上下相邻椎体,脱蛋白后石蜡固定切片,使用苏木精-伊红（HE）染色剂和阿利新蓝-核固红（Alcian Blue-Nuclear fast red）染色剂染色,电子显微镜下观察;其他样本剥离L5/6软骨终板、纤维环及髓核,放入EP管在-80℃冰箱中保存。Western-Blot法检测AKT-mTOR信号通路相关蛋白p-mTOR、p-AKT和自噬相关蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表达量。结果:1.光学显微镜观察HE染色的样本,对照组椎间盘相关组织明显退变,椎间盘有突出趋势,髓核皱缩,鹿茸多肽组、雷帕霉素组、鹿茸多肽+雷帕霉素组椎间盘退变对比对照组明显减轻,鹿茸多肽组退变程度最低,后两组之间则难以观察出区别。空白组在椎间盘形态学上未观察到退变迹象。Alcian Blue-Nuclear fast red染色的样本,鹿茸多肽组、雷帕霉素组、鹿茸多肽+雷帕霉素组对比对照组椎间盘内蛋白多糖和透明质酸含量明显升高,含量比较为鹿茸多肽+雷帕霉素组>鹿茸多肽组>雷帕霉素组,各组细胞核未见。2.Western-Blot检测AKT-mTOR通路蛋白检测:p-AKT（磷酸化的AKT）的表达水平排列为:鹿茸多肽+雷帕霉素组>鹿茸多肽组>对照组>雷帕霉素组,（P<0.05）;p-mTOR（磷酸化的mTOR）的表达水平排列为:鹿茸多肽+雷帕霉素组>鹿茸多肽组>对照组>雷帕霉素组,鹿茸多肽+雷帕霉素组与鹿茸多肽组差异不明显。雷帕霉素能对mTOR蛋白活化起到抑制作用,鹿茸多肽则对AKT-mTOR通路起到促进作用。自噬情况检测:LC3-Ⅱ的表达水平排列为:雷帕霉素组>雷帕霉素+鹿茸多肽组>对照组>鹿茸多肽组;LC3-Ⅱ/Ⅰ的比例排列为:雷帕霉素组>雷帕霉素+鹿茸多肽组>对照组>鹿茸多肽组。雷帕霉素能提高髓核细胞内的自噬水平,而鹿茸多肽会降低髓核细胞内的自噬水平。结论:1.鹿茸多肽能延缓双前肢去势法模型大鼠椎间盘的退变,且效果优于雷帕霉素。2.鹿茸多肽能提高椎间盘髓核细胞内AKT及mTOR的活化量,增加对下游自噬相关因子的抑制作用,进一步减少髓核细胞内的过度自噬。
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