背景:肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是常见的恶性肿瘤,其发病率在全世界范围呈上升趋势,肝癌患者总的生存期极短,手术复发率高,全身性化疗是治疗肝癌尤其是无手术指征的晚期肝癌的重要方法,但是现有的化疗药物疗效并不理想,存在很大程度的化疗抗拒现象。内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)是指由于细胞内外压力因素导致的一种亚细胞器的病理状态,表现为细胞内质网生理功能紊乱,钙稳态失衡,未折叠或错误折叠的蛋白质在内质网腔聚集。肝细胞癌,尤其是我国的肝癌,常由病毒性或酒精性肝炎发展而来,肝癌细胞长期处于病毒感染、炎症刺激等各种不良刺激下,加上肝癌组织快速增殖引起的缺血缺氧微环境,导致肝癌细胞较易处于内质网应激状态。现有文献报道和我们的研究基础表明ERS在肝癌的化疗抵抗和免疫逃逸中发挥着重要作用。巨噬细胞(Macrophages)是一类具有高度可塑性和功能多样性的免疫细胞,是肿瘤微环境中最多的免疫细胞,广泛参与肿瘤局部免疫微环境的塑造,在肿瘤的生长、侵袭、转移等过程中发挥重要作用。最近有研究发现,肿瘤细胞可以将ERS 信号传递给微环境中的巨噬细胞,导致其ERS相关基因转录编码的增加,同时伴有促炎细胞因子分泌的增加。外泌体(Exosomes)是直径在40-100nm之间的一种分泌出细胞外的小分子囊泡,广泛参与细胞间的通讯。与肿瘤的发生、发展与治疗等过程密切相关。外泌体作为传递蛋白质和核酸的载体已经被广泛证实,而外泌体是否能将肿瘤细胞的ERS信号传递给周围的巨噬细胞?巨噬细胞接受ERS信号后对肿瘤细胞的生物学行为有着怎样的影响?相关资料鲜有报道。本课题拟探讨在ERS微环境中,肝癌细胞是否通过外泌体将ERS信号传递至巨噬细胞,并进一步明确ERS巨噬细胞外泌体对肝癌凋亡的影响及可能的分子机制,为肝癌的临床治疗提供新思路。目的(1)探讨内质网应激与肝癌患者临床病理特征及其预后的关系(2)阐明肝癌细胞通过外泌体将内质网应激信号传递至巨噬细胞(3)明确内质网应激巨噬细胞外泌体对肝癌细胞凋亡的影响及其机制方法(1)收集142例经病理证实的原发性肝癌组织标本制作组织芯片,采用免疫组织化学法检测组织中GRP78的表达,并与患者的临床病理特征及预后数据分析相关性;采用免疫荧光法检测组织中巨噬细胞表面标记CD68以及ERS标志蛋白GRP78的表达,分析癌组织与癌旁组织中巨噬细胞ERS程度的差异;使用ERS诱导剂衣霉素(tunicamycin,TM)诱导肝癌细胞HepG2发生ERS,收集培养基上清并使用差速离心法分离外泌体;使用PMA诱导人单核细胞THP-1向巨噬细胞转化,将全培养基、外泌体、无外泌体培养基分别与巨噬细胞共培养,采用Western Blotting法检测巨噬细胞中GRP78的表达。(2)分别收集普通巨噬细胞和ERS巨噬细胞培养基,使用ExoQuick-TC试剂盒分离普通巨噬细胞外泌体(con-exo)和ERS巨噬细胞外泌体(ERS-exo),电子显微镜观察其形态,Western Blotting法检测CD63、Calnexin等标志蛋白的表达;使用PKH67对外泌体染色,并与HepG2细胞共培养,激光共聚焦显微镜观察HepG2细胞中PKH67的荧光强度。(3)体内实验以BALB/c nude小鼠为模型构建肝癌皮下移植瘤模型,通过尾静脉分别注射生理盐水、con-exo、ERS-exo,实验结束后处死小鼠,分离皮下移植瘤,测量称重后制作石蜡标本,H&E染色观察肿瘤形态特征,TUNEL法检测肿瘤凋亡。体外实验将con-exo、ERS-exo分别与ERS前后的肝癌细胞株HepG2和SMMC-7721共培养,流式细胞术和TUNEL法检测肝癌细胞凋亡。(4)将con-exo、ERS-exo分别与ERS前后的肝癌细胞株HepG2共培养,免疫荧光法检测HepG2细胞中LC3的荧光强度,电子显微镜观察HepG2细胞中自噬小体的形态特征,Western Blotting法检测HepG2细胞中LC3、P62、Beclin1等自噬相关蛋白的表达,检测ERS巨噬细胞及其外泌体中XPB1s的表达;使用si-IRE1转染巨噬细胞后,Western Blotting法检测其IRE1α和XBP1s 的表达。使用自噬抑制剂 chloroquine(CQ)和 3-Methyladenine(3-MA)预处理HepG2细胞,再加入con-exo、ERS-exo与HepG2共培养,流式细胞术和TUNEL法检测HepG2细胞凋亡。结果(1)免疫组化结果显示,GRP78阴性表达患者5例,低表达患者36例,高表达患者101例;GRP78表达与肝炎病史、肝硬化病史以及肿瘤大小等临床病理特征有关,GRP78高表达与低表达患者生存期差异具有显著性,GRP78高表达患者生存期更短。(2)免疫荧光结果显示,肝癌组织周围的巨噬细胞GRP78表达显著高于癌旁组织;Western Blotting结果显示,ERS的HepG2全培养基以及其外泌体均可以明显上调巨噬细胞内GRP78表达,而无外泌体培养基组中GRP78表达与对照组无明显差异。(3)电子显微镜下可以观察到直径40-100 nm的类圆形囊泡结构,符合外泌体的典型特征;Western Blotting检测到外泌体标志蛋白CD63的表达,同时未检测到排除蛋白Calnexin的表达;激光共聚焦显微镜在受体细胞HepG2的细胞质中观察到均匀散在的PKH67绿色荧光表达。(4)体内实验中,con-exo组小鼠皮下移植瘤的体积和重量均显著小于对照组,而ERS-exo组与对照组相比无显著差异。H&E染色可以观察到移植瘤组织内肿瘤的典型形态学特征,肿瘤细胞弥漫分布,细胞异型性明显,可见病理性核分裂像。TUNEL染色结果显示,con-exo组凋亡细胞比例明显增加,ERS-exo组与对照组相比未见显著差异。体外实验在HepG2和SMMC-7721两个细胞株中,流式细胞术和TUNEL染色结果均显示与con-exo共培养的HepG2细胞凋亡率显著增加,而与ERS-exo共培养其凋亡率未见显著差异。(5)免疫荧光法显示与ERS-exo共培养的ERS HepG2细胞中LC3荧光强度显著增强;电子显微镜观察到具有典型双层膜状结构的自噬小体,在相同大小的视野中该组自噬小体的数量多于其他各组;而con-exo对HepG2细胞的自噬水平无显著影响。Western Blotting检测到TM+ERS-exo组中LC3II/LC3I比例显著增高,P62表达明显降低,Beclin1表达明显增加,而TM+con-exo组中各种蛋白的表达与TM组相比未见显著差异。(6)使用TM诱导巨噬细胞发生ERS,Western Blotting法在ERS巨噬细胞以及外泌体中均检测到显著表达的XBP1s;使用si-IRE1转染巨噬细胞后,ERS巨噬细胞中IRE1α及XBP1s的表达显著减少。(7)使用CQ和3-MA预处理HepG2细胞后,免疫荧光法证实了两种自噬抑制剂预处理后,HepG2细胞自噬水平显著降低;流式细胞术和TUNEL法检测到在抑制自噬后,与ERS-exo共培养的ERS HepG2细胞凋亡率显著增加。结论(1)ERS标志蛋白GRP78在肝癌组织中普遍高表达,并且与肝炎病史、肝硬化病史和肿瘤大小等临床病理特征相关,是肝癌患者的预后不良因素。(2)肝癌细胞通过外泌体将ERS信号传递至微环境中的巨噬细胞,进而引起巨噬细胞内质网应激。(3)普通巨噬细胞外泌体可以促进ERS的肝癌细胞凋亡,而ERS后的巨噬细胞外泌体则会诱导肝癌细胞产生凋亡抵抗。(4)ERS巨噬细胞通过外泌体传递XBP1s并激活受体肝癌细胞自噬,是其诱导凋亡抵抗的可能机制,IRE1-XBP1-Beclin1是其中重要的分子通路。