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芽孢杆菌作为微生物农药广泛应用于植物体病虫害的生物防治,其在次级代谢过程中分泌的脂肽类物质是芽孢杆菌发挥生物活性的一个重要因素。通过对芽孢杆菌产生的抗菌脂肽的分离纯化及结构鉴定,可以为开发芽孢杆菌活体制剂应用于生物控制提供理论支持,同时为开发新的脂肽生物制剂奠定基础。本论文以12株具有生物活性的海洋芽孢杆菌为出发菌株,通过表面活性分析、抗菌活性测定及HPLC分析,确定了分离自中国南海3601 m深海沉积物中的芽孢杆菌SH-B10为目标菌株,对该菌株进行液体发酵,对发酵液中的抗菌脂肽进行分离纯化,并对纯的脂肽化合物进行了结构鉴定及活性分析,最后对海洋芽孢杆菌SH-B10进行了细菌学鉴定,主要结果如下。
(1)通过10 L自动智能发酵罐和摇瓶发酵两种方式对菌株SH-B10进行大批量发酵,采用酸沉淀后甲醇萃取、快速色谱及高效液相色谱技术从发酵液中成功分离得到了四个纯脂肽化合物1、2、3和4。采用ESI-MS测定该四个化合物的分子量,采用GC/MS分析四个化合物的脂肪酸组成,采用ESI-Q-TOF-MS确定化合物2和3的氨基酸组成及连接顺序,最后确定:2为C16 fengycin A,3为新型化合物6-Abu C16 fengycin,推测:1为新型化合物6-Gly C16 fengycin,4为C16 fengycin B。
(2)对化合物1、2、3和4的表面活性及乳化活性测试结果表明:在10mg/L时,化合物1、2、3和4可以将0.15 mol/L PBS(pH=8.0)的表面张力由52.1 mN/m分别降至44.8 mN/m、40.1 mN/m、42.5 mN/m及37.1 mN/m。在100 mg/L时,5 ml化合物1、2和3的PBS(pH=8.0)溶液对1ml甲苯的乳化率均能达到100%,35℃下48 h后该乳化活性不变。
(3)采用纸片扩散法测定化合物2和3对五种病原真菌:哈密瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumis melo L.),小麦玉米枯萎病菌(Fusariumgraminearum f.sp.zea mays L.),棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum),黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)和小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)的抑菌效果,发现2和3对五种待测病原真菌均表现出较强的浓度依赖型抗菌作用,二者的抗菌作用强度相似。
(4)采用经典的细菌学鉴定方法(形态观察,生理生化试验)及16S rDNA分子物学方法对海洋芽孢杆菌SH-B10菌株进行菌种鉴定,鉴定结果表明:SH-B10菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。