论文部分内容阅读
MicroRNA(miRNA)是一类长约22个核苷酸左右的非编码小分子RNA,通过碱基间的相互配对原则能与其靶基因进行特异性结合,进而调控靶基因的表达,在植物的生长发育,形态建成及抗逆反应中发挥重要的作用。MiR164是植物特有的一个microRNA家族,其最主要的靶基因是NAC家族。NAC是植物特有的一类转录因子,参与植物的细胞分裂,器官建成,逆境胁迫等应答过程。在前期的实验中,我们发现小麦中的miR164可能参与小麦响应水分胁迫的调节过程,但具体调节机制尚未明确。因此,深入研究miR164基因的功能,探讨其在小麦响应逆境胁迫时参与的相关信号途径以及调节机制,对于保证小麦稳产有重要的意义。本研究以小麦品种豫农211为材料,通过PCR扩增分别获得了6个miR164靶基因(NAC1,NAC2D,NAC4,NAC6A,NAC8,Suwon11)的全长序列;通过人工合成的方法获得了长度为276bp的小麦miR164前体的全长序列。在此基础上,构建了上述基因的过表达载体并转化拟南芥以获得转基因后代研究分析这些基因的功能。此外,利用合作研究单位提供的拟南芥miR164小串联目标拷贝(Short Tandem Target Mimic,STTM)转基因系,分析了miR164在植物应对环境胁迫过程中的作用。主要研究结果如下:1、以小麦反转录DNA为模板,通过PCR扩增,获得了6个NAC基因的全长序列,分别为:NAC1(核苷酸长度为1199 bp,开放阅读框长度为867 bp,编码289个氨基酸);NAC2D(核苷酸长度为1087 bp,开放阅读框长度为984 bp,编码327个氨基酸);NAC4(核苷酸长度为1088 bp,开放阅读框长度为936 bp,编码312个氨基酸);NAC6A(核苷酸长度为936 bp,开放阅读框长度为921 bp,编码307个氨基酸);NAC8(核苷酸长度为1287 bp,开放阅读框长度为1203 bp,编码401个氨基酸);Suwon11(核苷酸长度为1313 bp,开放阅读框长度为909 bp,编码303个氨基酸);此外,通过人工合成的方法获得了小麦miR164前体的全长序列(核苷酸长度为276 bp)。2、含酶切位点序列的上述基因扩增产物或人工合成产物,分别经限制性内切酶Nde I和EcoR I双酶切,目的片段经过电泳分离、纯化回收后,连接组装到双子叶植物过表达载体pRI101-an上并测序鉴定插入片段,成功构建了miR164及其6个NAC靶基因的植物过表达载体。然后,利用花粉管浸染的方法转化拟南芥植株,并筛选获得阳性苗,通过定量PCR(qPCR)技术分析检测各转基因系中相应基因的表达水平,获得了基因稳定表达的转基因后代。3、筛选获得了3个拟南芥STTM164转基因纯和系,其miR164表达水平均受到明显抑制;利用这些转基因系进行干旱和高温胁迫处理,结果显示:1)干旱胁迫下,与野生型相比,STTM系植株表现出叶片更加坚挺,不卷曲,叶片颜色未出现发紫现象,只有轻微的墨绿色;展现出更抗旱的性状,且植株叶片的生物量和绝对含水量均明显高于野生型植株;2)40℃高温处理48 h后,与野生型相比,STTM系幼苗表现出更耐高温的性状,叶片不倦缩,植株叶片鲜重,干重和绝对含水量变化均表现出较高水平。上述结果表明miR164可能广泛参与植物逆境胁迫响应的调节,并在这些生理适应过程中起着重要的调节作用。