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昼夜节律生物钟(circadian clock)参与机体各项生理功能的调节,如血脂、血压、碳水化合物代谢、激素(包括胰岛素、瘦素、糖皮质素等)分泌、凝血因子分泌以及进食行为等,昼夜节律产生的分子基础来源于生物钟基因(circadiangene)之间的协调表达,即转录-翻译反馈环路。中枢生物钟基因位于下丘脑视交叉上核(suprachiasmatic nucleus,SCN),外周组织也有类似的生物钟基因表达,而对生理功能的调节是各钟基因通过调控下游钟控基因(clock-controlledgenes,CCGs)的表达来实现的。已有研究表明一些钟基因表达的改变参与到疾病的发生发展,如心血管系统疾病、神经系统疾病、肿瘤等。在心血管系统疾病中,急性心肌梗塞(acute myocardial infarction)、中风(stroke)和心源性猝死(sudden cardic death)发病具有明显的昼夜节律,在早晨高发。其发病机制目前尚不清楚。这些疾病主要是动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的终末期并发症。动脉粥样硬化是一种多因素参与的慢性疾病,其病因复杂包括炎症、细胞凋亡与增殖、脂质代谢紊乱等。其中脂质代谢紊乱是其重要的代谢性危险因素。在正常情况下,生物钟通过调控下游与脂质代谢相关钟控基因的表达,参与脂质代谢。当这个调控通路发生异常时,可引起血脂异常,胰岛素抵抗,肥胖,高血压等。血清中血脂增高尤其氧化型LDL的升高促使一些炎症介质、自由基释放增加,影响内皮细胞功能,引起血管壁炎症,易于脂质沉积于内皮下,炎症因子如血管细胞粘附分子-1、E-选择素等促使单核细胞进入内皮下,分化为巨噬细胞,吞噬脂质后转化成泡沫细胞,促进脂纹的形成,内皮细胞的过度凋亡,使得脂质沉淀增多,斑块增大,血管平滑肌的凋亡不足,使得血管壁增厚变硬,斑块易于破裂,导致血栓性疾病的发生。同时生物钟基因还参与细胞凋亡与增殖、炎症反应、凝血功能、血压等的调控,而这些功能的异常与动脉粥样硬化的发生有关,那么作为动脉粥样硬化危险因素之一的脂质代谢紊乱是否对生物钟基因的表达有影响?目前国内外的报道较少,我们以往的研究发现,apoE基因敲除(apoE-/-)动脉粥样硬化小鼠模型中,心脏生物钟基因和钟控基因表达紊乱。有研究表明,高脂饮食能够影响小鼠生物钟基因的表达,而生物钟基因参与脂质代谢的调节,所以我们推测在apoE-/-小鼠动脉粥样硬化形成过程中,生物钟基因表达节律的改变可能与脂质代谢紊乱有关,生物节律的紊乱又影响脂质的代谢,从而形成脂质代谢的恶性循环,导致动脉粥样硬化的发生发展。为此,我们利用apoE-/-小鼠,分别给予普通和高脂饮食,建立动脉粥样硬化的早期和进展期动物模型,检测与脂质代谢密切相关的肝脏组织、与动脉粥样硬化发生密切相关的心脏组织、参与调控各项生理功能的中枢组织钟基因的表达节律变化,研究动脉粥样硬化(AS)病理过程中引起生物钟基因表达变化的机制,进一步研究脂质代谢与生物钟基因之间的关系,为研究动脉粥样硬化的发病机制提供新的理论依据。本课题采用36只3月龄的雄性apoE-/-小鼠,分为两组,每组18只,在12小时光照/12小时黑暗(L/D)的环境下饲养2周,后转入12小时黑暗/12小时黑暗(D/D)环境下继续饲养3周。一组给予普通饮食,一组给予高脂饮食,以18只同龄雄性C57BL/6J小鼠作为对照,根据Circadian Time(CT用来评估生物体内在生物学时间,CT0被定为主观性早晨,CT12被定为主观性夜晚),分别在CT0、CT4、CT8、CT12、C1l6、CT20六个时间点处死小鼠,检测血清中总胆固醇、LDL-CHO、HDL-CHO的含量;取小鼠主动脉起始段做冰冻切片,油红O染色检测动脉粥样斑块;利用Real-time PCR检测普通饮食和高脂饮食apoE-/-与C57BL/6J小鼠中枢、心脏和肝脏钟基因(mPer2,mBmall,mClock,mCry1,mRev-erbα)在不同时间点的表达变化。结果显示给予普通饮食的apoE-/-小鼠尚未形成明显的粥样斑块,但其主动脉内皮下已经形成脂肪泡沫细胞,血清总胆固醇和LDL-CHO明显增高,HDL-CHO则明显降低;给予高脂饮食的apoE-/-小鼠主动脉有明显的脂质沉积,动脉粥样硬化斑块明显,其血清总胆固醇和LDL-CHO更高,HDL-CHO含量更低。因此,给予普通饮食与高脂饮食的apoE-/-小鼠分别处于动脉粥样硬化的早期与进展期。Real-time PCR结果显示:apoE-/-小鼠中枢、心脏中生物钟基因除mClock外mPer2,mBmall,mCry1和mRev-erbαmRNA水平的表达均呈现昼夜节律,而在肝脏中的表达都表现出昼夜节律。在普通饮食和高脂饮食apoE-/-小鼠中枢生物钟基因mRNA水平表达幅度无明显变化,表达节律发生改变。在心脏中,普通饮食和高脂饮食的apoE-/-小鼠mPer2 mRNA表达高峰和低谷分别延后4小时,出现在CT12、CT0上,相对于C57BL/6J表达高峰和低谷在CT8、CT20;而mBmall的mRNA表达节律与之相反,呈反时相表达。与C57BL/6J小鼠中表达高峰和低谷出现在CT20和CT8相比,普通饮食和高脂饮食的apoE-/-小鼠中其表达高峰和低谷分别延后4小时,出现在CT0和CT12。在高脂饮食的apoE-/-小鼠中,mCry1基因mRNA水平的表达在暗周期CT12,CT16,CT20上高于普通饮食的apoE-/-小鼠。在肝脏组织中apoE-/-小鼠mBmall,mPer2,mClock,mCry1 mRNA水平在多个时间上表达震幅降低伴有节律改变。CT0时,普通饮食和高脂饮食的apoE-/-小鼠mRev-erbαmRNA水平在中枢、心脏和肝脏的表达幅度均低于C57BL/6J小鼠,表达高峰与C57BL/6J小鼠相比分别延后4个小时,分别出现在CT8和CT12,表达低谷无明显变化。结合本实验以及本课题组以往实验结果,我们发现动脉粥样硬化apoE-/-小鼠多个生物钟基因和许多动脉粥样硬化相关的生物钟调节基因表达发生变化,推测可能存在某个或某些转录因子的表达改变,导致生物钟基因转录水平表达的紊乱。因此,我们分析了数百个可能与上述生物钟基因上游调控区结合的转录因子,其中mRev-erbα,mPPARα,mRXRα,mHNF-3α,mHNF-3β,mPPARγ出现频率较高,而与脂质代谢和心血管疾病密切相关的转录因子有mRev-erbα,mPPARα,mRXRα,检测他们在中枢、心脏和肝脏中mRNA水平的表达。结果显示:作为生物钟基因的mRev-erbα同时又是转录因子,在中枢、心脏和肝脏中mRNA水平表达节律和幅度都有变化。脂质代谢相关因子mPPARα,mRXRα在SCN、心脏的表达无明显变化,在肝脏表达变化明显。给予高脂饮食的apoE-/-小鼠中mPPARα,mRXRαmRNA水平的表达与普通饮食apoE-/-小鼠中的表达相比,在CT0,CT4,CT8上表达幅度明显增高,大约2-6倍。综上所述,在apoE-/-动脉粥样硬化小鼠模型中,中枢生物钟基因表达幅度无明显变化,表达节律发生变化。心脏生物钟基因主要表现为表达峰值的延后伴有表达幅度的改变。而肝脏中生物钟基因主要表现为表达幅度的降低,他们上游转录调控区共同含有的脂质代谢相关因子mPPARα,mRXRαmRNA水平表达幅度明显增高,说明脂质代谢相关因子与肝脏中生物钟基因转录水平表达降低有关。脂质代谢紊乱影响了生物钟基因的表达,可能是通过影响生物钟基因转录因子的表达来实现的,且不同组织生物钟基因表达改变形式不同,这些改变可能在动脉粥样硬化的病理过程中发挥了重要作用,对其具体作用以及发生机制仍在进一步研究中。