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目的:非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是以肝脏脂肪蓄积和异常脂质代谢为特征的慢性肝脏疾病。随着生活方式的全球转型,NAFLD患者人口急速上升,现已成为21世纪全球重要的公共健康问题之一,给社会带来了巨大的经济负担。近年来,大量研究已经显示NAFLD中微小RNA(microRNA,miRNA)谱发生改变,探索通过miRNA靶向治疗NAFLD及相关病变的新兴分子机制引起了研究者的注意。有研究报道,miR-21及低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein,LDL)受体相关蛋白6(LDL receptor-related protein 6,LRP6)均参与NAFLD的发生、发展,但miR-21是否可以作为其治疗靶标以及miR-21与LRP6之间的关系均是未知的。在本研究中,使用NAFLD的体外细胞模型进行实验,以研究mi R-21对脂质合成和分泌的影响,并确定miR-21对NAFLD发挥其作用的新靶标。方法:(1)使用软脂酸(Palmitic acid,PA)和油酸(Oleic acid,OA)(1:2)混合物(PA/OA)干预Hep G2细胞建立NAFLD体外细胞模型。用siRNA技术沉默PA/OA干预后HepG2细胞中的miR-21表达,用miR-21 mimic或对照(control)mimic转染PA/OA干预后Hep G2细胞使miR-21表达上调,然后监测miR-21对胆固醇(Cholesterol,C),胆固醇酯(Cholesteryl ester,CE),甘油三酯(Triglyceride,TG)和磷脂(Phospholipid,PL)合成和分泌的影响;(2)miR-21 mimic或controlmimic,mir-21antagomir或controlantagomir转染pa/oa干预后hepg2细胞分别上调和阻断mir-21的表达,检测lrp6表达;(3)实时荧光定量pcr和蛋白免疫印迹(westernblot)分析检测参与脂质代谢的基因,包括肝脏x受体α(liverxreceptorα,lxrα),硬脂酰辅酶a去饱和酶1(stearoyl-coadesaturase1,scd1),乙酰辅酶a羧化酶1(acetyl-coacarboxylase1,acc1),和固醇调节元件结合蛋白1(sterolregulatoryelementbindingprotein1,srebp1)等,以及lrp6在mrna和蛋白质水平的表达;(4)运行targetscan程序,之后将lrp63’非翻译区(untranslatedarea,utr)或lrp6突变的3’-utr克隆到荧光素酶报告基因载体中,lxra3’-utr克隆到荧光素酶报告基因载体作为阴性对照,之后分别与mir-21mimic或controlmimic共转染pa/oa干预后hepg2细胞进行双荧光素酶报告基因检测,探讨mir-21表达水平对lrp6的影响。结果:(1)mir-21mimic转染pa/oa干预后hepg2细胞可以使除了ce之外的脂类,包括c,tg,pl合成和分泌增加,实时荧光定量pcr显示mir-21表达上调可以诱导编码脂肪生成酶基因,包括acc1,scd1,srebp1和lxrα等的表达增加;(2)mir-21mimic转染pa/oa干预后的hepg2细胞,实时荧光定量pcr和westernblot显示lrp6在mrna和蛋白质水平表达降低。反之,mir-21antagomir转染却使lrp6的表达水平增加;(3)运行targetscan程序,显示lrp6为mir-21的潜在靶标。双荧光素酶报告基因检测显示,lrp63’-utr和mir-21mimic共转染的细胞中荧光素酶活性显著降低,mir-21mimic的转染对lrp6突变的3’-utr和lxra3’-utr的荧光素酶活性没有任何影响。结论:mir-21在nafld的体外细胞模型中调节脂类代谢,该作用通过抑制LRP6的表达来实现。LRP6是mi R-21的新靶标。mi R-21可能是通过靶向内源性LRP6治疗NAFLD的新策略。