论文部分内容阅读
背景:microRNAs(miRNAs)为小分子RNA,通过转录后水平调节靶基因,影响转录因子、信号分子表达。肌相关microRNAs(MyomiRs)为特异性表达在肌组织中的miRNAs,在肌发育过程中起到重要调控作用[1],其成员miR-1/206能够直接靶向盒转录因子Pax7,抑制其基因表达和蛋白翻译[2]。肌肉组织发育决定了肌纤维数量,大小,纤维类型。在这个多阶段进程中,分化过程对决定肌细胞命运和最终肌组织的形成是十分重要的,在调控该过程的多种基因中,MRF和MEF2家族是最重要的转录因子,其成员Myo D和Myf5被认为在成肌细胞形成早期起到决定作用。在Myo D/Myf5的众多调控因子中,Pax家族成员Pax7能够直接靶向作用于Myo D/Myf5,维持成肌细胞增殖并抑制其早期分化,进而对骨骼肌发育起到负向调控作用[3]。已有文献报道,MyomiRs成员miR-1/206与Pax7和Myo D/Myf5之间存在直接靶向关系,能够形成一个完整的反馈环路[2],调控肌前体细胞由增殖向分化的转变过程。在上述靶向关系中某一成员的表达水平或调控作用受到影响即会造成细胞分化异常,进而导致发育畸形的发生,其具体机制被认为与环境因素和遗传因素有关。维甲酸(Retinoic acid,RA)是体内维生素A的代谢中间产物,因在多种皮肤病及肿瘤治疗方面的广泛应用而成为腭发育畸形的常见环境因素。本组已有研究证明,RA诱导小鼠胚胎腭裂模型中常伴有舌肌发育异常,具体表现在舌肌纤维走形及相关成肌调节因子(MRFs)表达异常[4],我们推测该过程中miR-1/206与Pax7、Myo D/Myf5之间的靶向作用关系可能为一项关键调节机制。本组前期结果已证实,RA诱导小鼠腭裂伴舌组织发育异常模型中,miR-1/miR-206表达下调,Pax3/Pax7表达上调,进而Myo D/Myf5表达下调,因此抑制胎鼠的舌肌分化,致使舌肌的发育发生异常,即该过程中上述各miRNAs与转录因子表达之间的相关性具有重要调控作用。但这种相关性在RA诱导细胞肌向分化异常过程中的调控作用深层机制仍未见明朗。目的:通过探究过量RA条件下,miR-1/206靶向Pax7在C2C12细胞分化早期所起的调控作用,为MyomiRs在肌向分化早期的作用机制研究提供相关理论依据。方法:1.观察生理状态及过量RA条件下C2C12细胞形态学变化的影响;检测分化早期不同阶段miR-1/206,Myo D、Myf5以及Pax7的表达水平。2.应用脂质体转染技术,上调C2C12细胞中miR-1、miR-206的表达,观察生理状态及过量RA条件下C2C12细胞形态学变化,并检测Pax7和Myo D、Myf5的表达水平。结果:1.随分化时间的延长,C2C12细胞形态拉长,多核肌管形成数目增多。过量RA作用下,细胞排列紊乱,多核肌管形成数量减少,分化受到抑制;miR-1相对表达量在各个阶段均低于正常组(p<0.01);miR-206表达水平在D0.5显著低于正常组(p<0.01);Pax7相对表达量在D1、D2显著高于正常组(p<0.01);Myo D相对表达量在分化早期各个阶段均低于正常组,且在D1、D2结果具有显著性差异(p<0.01);Myf5的表达在各时间点均显著低于正常组(p<0.01)。2.过表达miR-1、miR-206后,细胞长度增加,多核肌管形成数量增多,能够在一定程度上挽救由RA造成的分化抑制。上调miR-1后,Pax7表达水平低于NC组(p<0.01);Myf5表达水平高于NC组(p<0.01);过量RA作用下Myf5表达水平仍高于NC组(p<0.01)。上调miR-206后,Pax7表达水平低于NC组(p<0.01);Myo D、Myf5表达水平高于NC组(p<0.01;p<0.05);过量RA作用下Pax7表达水平低于NC组(p<0.01);Myf5的表达仍显著高于NC组(p<0.01)。结论:上调miR-1、miR-206能够通过靶向调控Pax7在一定程度上挽救过量RA导致的C2C12细胞分化延迟。