天然型调节T细胞(naturally occurring Treg,n Treg)细胞具有抑制T细胞增殖和抑制炎症免疫应答的功能,约占外周CD4+T细胞的5-10%,参与维持免疫系统稳态。Treg功能失调常导致严重的自身免疫病甚至死亡。研究Treg细胞功能的调节机制对于探讨相关自身免疫病的发病机制具有重要意义。髓系DC即为“经典”的、常规意义上的DC(conventional DC,c DC),研究证实,c DC在诱导n Treg细胞应答中发挥重要作用。根据刺激T细胞的能力不同,c DC具有未成熟(immature DC,i DC)与成熟(mature DC,m DC)两种状态。i DC具有高效的抗原摄取和处理能力,但其对T细胞的激活作用较差,抗原提呈能力较弱。遇到感染等刺激信号后,i DC捕获抗原,随即对抗原进行加工处理,同时向淋巴器官迁移,逐渐成熟,增殖并分泌多种细胞因子,高表达MHC类分子,上调协同刺激分子的表达,其呈递抗原的能力逐渐增强,而摄取、加工处理抗原的能力逐渐减弱,最终发育为m DC。研究证实,i DC刺激Treg细胞增殖能力差,而活化的c DC可以诱导Treg增殖,由此废除其无能状态。上述研究结果表明,DC对Treg的调节作用与其成熟状态密切相关,因此,研究DC表型和功能的调控机制将为Treg功能失衡的相关免疫性疾病的防治提供新的思路。胆囊收缩素(cholecystokinin,CCK)是一种典型的脑肠肽和免疫调节肽。八肽胆囊收缩素(cholecystokinin octapeptide,CCK-8)是最主要的活性形式。CCK-8作为免疫调节剂,其通过细胞表面的CCKR(CCK receptor,CCKR)发挥免疫调节作用。CCKR包括CCK1R和CCK2R两种受体,二者均属于G蛋白偶联受体家族。CCK1R主要在胃肠系统表达,CCK2R则在胃和中枢神经系统表达。CCK受体后有多种信号通路,其中包括CCKR与Gs蛋白偶联的c AMP-PKA通路,与Gα偶联的DAG-PKC通路,多种信号通路之间又相互作用,最终发挥生物学效应。国内外研究报道以及本实验室前期研究结果表明,CCK-8具有抗炎和调节免疫细胞分化、趋化和免疫杀伤等作用,如CCK-8通过免疫细胞表面的其受体CCK-R抑制CD40L和Cp G ODN诱导的人外周血p DC的成熟活化,抑制CD80和CD86等表面分子的表达,同时抑制同种异体CD4+T细胞增殖。研究发现,人外周血c DC也表达CCKR。因此我们推测CCK-8可能会对人外周血c DC发挥调节作用,从而调节Treg细胞的功能。基于上述研究,本课题使用免疫磁珠法分选健康人外周血来源的CD14+单核细胞,体外诱导其分化为i DC和m DC,观察CCK-8体外作用对不同状态的c DC的表型调节作用及经CCK-8处理后不同状态的c DC对Treg细胞功能的影响,并进一步探讨CCK-8发挥此调节作用的分子机制和受体机制。此外,本课题还观察了CCK-8在炎症介质PGE2调节的Treg细胞分化和功能中的作用,从而进一步观察CCK-8的免疫调节作用。第一部分八肽胆囊收缩素对人外周血c DC表型的影响目的:本部分研究使用免疫磁珠法分选健康人外周血来源的CD14+单核细胞,诱导其向c DC的i DC和m DC分化,以观察CCK-8对i DC和m DC的表型调节作用。方法：1免疫磁珠法分选健康人外周血来源的CD14+单核细胞,用流式细胞术鉴定CD14+单核细胞纯度。分选后的CD14+单核细胞,在含人重组GM-CSF(100ng/ml)和IL-4(50ng/ml)和10%胎牛血清的RPMI1640完全培养基中培养6天,获得i DC,用流式细胞术检测CD1a+CD14-细胞阳性率,证明细胞诱导成功,给予LPS(1μg/ml)刺激48h,获得m DC。2 CCK-8对i DC和m DC的DC-SIGN CD209和成熟标记CD83的表达的影响:将分选纯化后的CD14+单核细胞按上述方法向i DC分化,在此过程中,同时给予不同浓度的CCK-8,即分为六组:control组;CCK-8组(10-6、10-7、10-8、10-9、10-10M)组。获得的i DC给予LPS(1μg/ml)刺激其成熟,同时给予不同浓度的CCK-8,即分为六组:control组;CCK-8组(10-6、10-7、10-8、10-9、10-10M)组。收集不同因素作用的各组细胞,采用流式细胞术检测不同状态的DC表面CD209和CD83的表达,RT-PCR方法检测不同状态的DC CD209和CD83 m RNA的表达。3 CCK-8对不同状态的DC CD80、CD86、HLA-DR和GITR-L表达的影响:细胞分化和实验分组同方法2,收集不同因素作用的各组细胞,采用流式细胞术检测不同状态的DC表面CD80、CD86和HLA-DR、GITR-L表达。结果： 1经磁珠分选的CD14+单核细胞纯度达90%以上,经分选的CD14+单核细胞GM-CSF(100ng/ml)和IL-4(50ng/ml)作用下,培养5天,CD1a+CD14-细胞达到(62.45±10.63)%,证明成功诱导了DC。2 i DC表达低水平的DC-SIGN CD209和成熟标记CD83,而m DC CD209和CD83的表达水平升高(P<0.05)。CCK-8剂量依赖性的抑制了i DC和m DC表面的DC-SIGN CD209和成熟标记CD83的表达和二者m RNA的表达,其中10-6M作用最强,10-6M和10-7M作用与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。3 i DC表达较低水平的CD80、CD86、HLA-DR和GITR-L,而m DC CD80、CD86、HLA-DR和GITR-L的表达水平增高(P<0.05),CCK-8剂量依赖性的抑制了i DC和m DC表达的CD80、CD86和HLA-DR,其中10-6M作用最强,10-6M和10-7M作用与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。小结:本实验证实CCK-8可以抑制i DC和m DC表达DC-SIGN CD209、CD83、CD80、CD86、HLA-DR和GITR-L,表明CCK-8对i DC和m DC的表型有抑制作用。c DC除了具有i DC和m DC两种状态之外,还存在半成熟状态(semi-mature DC),即t DC,其表达的表面分子水平比m DC表达水平低,上述结果提示CCK-8可以诱导半成熟状态的DC即致耐受DC(tolerogenic DC,t DC)生成。第二部分八肽胆囊收缩素对c DC调节Treg细胞功能的影响目的:第一部分研究证实,CCK-8对m DC的表型具有抑制作用,但可以诱导t DC生成,可见CCK-8对c DC表型和功能调节作用的复杂性,由于CD80/CD86和GITR-L是调节Treg细胞功能的共刺激分子,推测CCK-8可能通过调节DC进而对Treg细胞的功能产生影响,那么CCK-8对c DC调节Treg细胞功能究竟有何影响,本部分研究观察了CCK-8对i DC/m DC调节Treg功能的影响。实验采用DC与Treg共培养的方法,观察经CCK-8处理的DC在Treg细胞功能调节中发挥何种作用,以期进一步揭示CCK-8在免疫调节中的作用。方法： 1免疫磁珠法分选人外周血CD4+CD25+Treg细胞和CD8+T细胞,流式细胞术鉴定纯度。2 CCK-8对DC调节Treg细胞表面分子表达以及细胞因子分泌的影响:DC培养方案同第一部分,收集细胞,用50μg/ml丝裂霉素C(mitomycin-C,MMC)37°C孵育0.5h后,将CCK-8作用的i DC/m DC与Treg细胞按1:5(1×105:5×105)的比例,进行共培养,48h后采用流式细胞术检测Treg细胞表面分子CTLA-4和GITR的表达,ELISA方法检测培养上清中TGF-β和IL-10的含量。3 CCK-8对DC调节Treg增殖能力的影响:将CCK-8作用的i DC/m DC与经CFSE染色的Treg细胞按1:5(1×105:5×105)的比例,进行共培养,5d后,流式细胞仪上机分析Treg细胞的增殖情况。4 CCK-8对m DC调节的Treg细胞对效应T细胞增殖的影响:将CCK-8作用的m DC与Treg细胞分别和CD4+Teff/CD8+Teff按1:5:5(1×105:5×105:5×105)的比例进行共培养,培养4d,Brd U掺入法检测CCK-8对m DC调节的Treg细胞对CD4+Teff/CD8+Teff增殖的抑制作用。结果：1经磁珠分选后的CD4+CD25+Treg细胞和CD8+T细胞纯度均达90%以上。2与control组相比,CCK-8作用的m DC上调了Treg细胞CTLA-4和GITR的表达以及IL-10和TGF-β,差异有统计学意义(P<0.05),而CCK-8作用的i DC则对上述分子表达和细胞因子分泌未见明显影响。3 CCK-8作用的mDC促进了Treg细胞的增殖,与control组相比,差异有统计学意义(P<0.05),而CCK-8作用的i DC对Treg细胞增殖未见显著影响。4与control组相比,CCK-8在m DC调节的Treg细胞抑制效应T细胞增殖功能中发挥了促进作用,差异有统计学意义(P<0.05)。小结:本实验证实CCK-8作用的mDC既可以促进Treg细胞的抑制功能,又可以促进Treg细胞增殖。由于CCK-8抑制m DC的表型,因此本研究推测CCK-8的上述作用可能与其诱导t DC的生成有关。而i DC及CCK-8作用的i DC对Treg细胞的功能则无影响。第三部分八肽胆囊收缩素在c DC调节Treg细胞功能中的作用机制目的:第一部分和第二部分研究证实,CCK-8抑制DC的表型成熟,但促进DC调节的Treg细胞的功能,此作用可能与其诱导t DC的生成有关。由于CD80/CD86和GITR-L是调节Treg细胞功能的共刺激分子,因此本部分研究应用anti-CD80/CD86和anti-GITR-L观察CCK-8诱导的t DC调节的Treg细胞功能的变化,从而证实CCK-8是否通过调节DC表达的CD80/CD86和GITR-L进而对Treg细胞的功能产生影响。同时探讨CCK-8在c DC调节Treg细胞功能中的受体机制。方法：1 CD80、CD86和GITR-L对CCK-8诱导的t DC调节Treg细胞表面分子表达以及细胞因子分泌的影响:CTLA-4分组:实验分为:Control组;CCK-8组;anti-CD80+CCK-8组;anti-CD86+CCK-8组;anti-CD80+anti-CD86+CCK-8组。GITR分组:Control组;CCK-8组;anti-GITR-L+CCK-8组。培养48h,流式细胞术检测CTLA-4和GITR的表达。收集上述各组培养上清,ELISA法检测上清中TGF-β和IL-10的含量。2 CD80、CD86和GITR-L在CCK-8诱导的t DC调节Treg增殖中的作用:实验分为:Control组;CCK-8组;anti-CD80+CCK-8组;anti-CD86+CCK-8组;anti-CD80+anti-CD86+CCK-8组;anti-GITR-L+CCK-8组。CFSE染色法检测Treg细胞增殖情况。3 CD80、CD86和GITR-L对CCK-8诱导的t DC调节Treg抑制效应T细胞增殖能力的影响:实验分为:DC+Treg+Teff;CCK-8+DC+Treg+Teff;anti-CD80+CCK-8+DC+Treg+Teff组;anti-CD86+CCK-8+DC+Treg+Teff组;anti-CD80/anti-CD86+CCK-8+DC+Treg+Teff组;anti-GITR-L+CCK-8+DC+Treg+Teff组。4天后收集细胞,Brd U掺入法检测Teff增殖情况。4 CCK-8诱导t DC表达CD80、CD86和GITR-L的受体学作用:收集分选的单核细胞,培养DC成熟活化,实验分为:control组;CCK-8组;CCK1R拮抗剂(Devazepid)+CCK-8组;CCK2R拮抗剂(L365260)+CCK-8组;Devazepid+L 365260+CCK-8组。收集不同因素作用的细胞,流式细胞术检测CD80、CD86和GITR-L的表达。5 CCK-8诱导的t DC调节Treg细胞表面分子表达以及细胞因子分泌的受体学作用:细胞按上述条件培养,收集细胞,用50μg/ml MMC 37°C孵育0.5h后,与Treg细胞共培养,流式细胞术检测CTLA-4和GITR的表达,收集细胞上清,ELISA法检测培养上清中TGF-β和IL-10的含量。6 CCK-8诱导的t DC调节Treg增殖的受体作用:按上述条件培养的DC与CFSE染色的Treg细胞共培养,5天后,收集细胞,流式细胞仪检测Treg细胞增殖情况。7 CCK-8诱导的t DC调节Treg抑制效应T细胞增殖能力的受体作用:按上述条件培养的DC与Treg细胞和效应T细胞按1:5:5(1×104:5×104:5×104)分别与CD4+Teff和CD8+Teff共培养,4天后Brd U插入法检测Teff增殖情况。8 CCK-8对DC成熟活化过程中PKA/PKC活性的影响:收集分选的单核细胞,培养DC成熟活化,实验分为:control组;CCK-8组;Devazepid+CCK-8组;L 365260+CCK-8组和Devazepid+L 365260+CCK-8组。收集不同因素作用的细胞,提取细胞蛋白,应用Protein Kinase A Activity Assay Kit检测DC胞内PKA活性,用Protein Kinase C Activity Assay Kit检测胞内PKA活性。结果： 1 anti-CD80和anti-CD86单独或共同作用均能下调CCK-8诱导的t DC促进CTLA-4作用(P<0.05),anti-GITR-L则抑制了CCK-8诱导的t DC对GITR表达的调节作用(P<0.05)。各抗体单独或共同作用,对CCK-8诱导的t DC调节的Treg分泌的TGF-β未见显著影响(P>0.05),仅anti-CD80和anti-CD86共同作用可以下调CCK-8诱导的t DC调节的Treg细胞分泌的IL-10的作用(P<0.05)。2 anti-CD80和anti-CD86对CCK-8在DC调节的Treg细胞增殖作用中未见显著影响,而二者共同作用,则能部分抑制CCK-8诱导的t DC促进Treg细胞增殖的作用,anti-GITR-L也明显下调了CCK-8诱导的t DC促进Treg细胞增殖的作用(P<0.05)。3 anti-CD80和anti-CD86对CCK-8诱导的t DC调节的Treg细胞抑制Teff增殖未见显著影响,二者共同作用可下调CCK-8诱导的t DC促进Treg的抑制效应,而加入anti-GITR-L组可以拮抗t DC促进的Treg细胞抑制效应(P<0.05)。4 L 365260单独作用或与Devazepid一起作用,可以逆转CCK-8所抑制的CD80、CD86和GITR-L的表达(P<0.05),而Devazepid作用对CCK-8抑制的CD80、CD86和GITR-L的表达未见明显影响(P>0.05)。5 L 365260单独作用或与Devazepid一起作用,可以抑制CCK-8促进DC调节的Treg细胞表面分子CTLA-4和GITR的表达和细胞因子TGF-β和IL-10的分泌(P<0.05),而Devazepid作用对CTLA-4和GITR的表达和TGF-β和IL-10的分泌未见明显影响(P>0.05)。6 L 365260单独作用或与Devazepid一起作用,可以抑制CCK-8对DC调节的Treg增殖的促进作用,而Devazepid作用对Treg增殖的调节与CCK-8处理组相比,未见明显影响(P>0.05)。7 L 365260单独作用或与Devazepid一起作用,可以抑制CCK-8上调的Treg细胞对效应T细胞增殖的抑制作用(P<0.05),而Devazepid单独作用,与CCK-8处理组相比,未见显著影响(P>0.05)。8 CCK-8可显著升高PKA的活性而抑制PKC的活性(P<0.05),L 365260单独作用或与Devazepid一起作用,可以翻转CCK-8对PKA和PKC活性的影响(P<0.05),而Devazepid单独作用,与CCK-8处理组相比,未见显著影响(P>0.05)。小结:本实验结果提示:anti-CD80/CD86和anti-GITR-L的应用进一步确定了CCK-8在DC调节Treg细胞功能中CD80、CD86和GITR-L发挥的调节作用。CCK-8通过抑制DC表达的CD80/CD86和GITR-L进而促进Treg细胞的功能。CCK-8通过CCK2R抑制m DC表达共刺激分子CD80、CD86和GITR-L,进而对Treg细胞的功能发挥调节作用。CCK-8受体后PKA和PKC通路参与CCK-8调节DC的作用,进而对Treg细胞的功能发挥了调节作用。第四部分八肽胆囊收缩素在PGE2调节的Treg细胞分化中的作用目的:DC在病毒等刺激下分泌大量的炎症介质PGE2,发挥炎症作用,而CCK-8具有抗炎作用,因此我们外源性给予PGE2,观察其对人外周血初始CD4+T细胞分化为Treg细胞的调节作用机制以及CCK-8在PGE2对Treg细胞分化和功能中的调节作用,以其进一步揭示CCK-8在免疫系统中发挥的免疫抗炎调节作用。方法： 1 EP受体在PGE2抑制Treg细胞分化中的作用:收集分选后的na?ve CD4+T细胞,诱导其向Treg细胞分化,首先观察EP受体激动剂在Treg细胞分化中的作用,实验分为:control组;PGE2组;Butaprost组;Sulprostone组;L-902,688组。之后观察EP2/EP4拮抗剂在PGE2调节的Treg细胞分化中的作用,实验分为:control组;PGE2组;AH6809+PGE2组;GW627368X+PGE2组。细胞培养7天,流式细胞术检测CD25+Foxp3+细胞数量,RT-PCR方法检测Foxp3 m RNA的表达。2 PGE2对诱导分化的Treg细胞中c AMP含量和PKA活性的影响:将诱导成功的Treg细胞分为:control组;PGE2组;Butaprost组;L-902,688组;db-c AMP组;AH6809+PGE2组;GW627368X组+PGE2组。用免疫荧光法测定胞内c AMP的含量,用Protein Kinase A Activity Assay Kit检测Treg胞内PKA活性。3 c AMP-PKA通路在PGE2抑制Treg细胞分化及其功能中的作用:诱导Treg细胞定向分化,实验分为:control组;PGE2组;db-c AMP组;H-89+PGE2组;Butaprost组;H-89+Butaprost组;L-902,688组;H-89+L-902,688组。流式细胞术检测CD25+Foxp3+细胞数量和CTLA-4和GITR的表达,RT-PCR方法检测Foxp3 m RNA的表达,ELISA方法检测培养上清中IL-10的含量。4 CCK-8在PGE2抑制Treg细胞分化及其功能中的作用:收集分选后的细胞,诱导其向Treg细胞分化,实验分为:control组;PGE2组;CCK-8组;CCK-8+PGE2组。流式细胞术检测CD25+Foxp3+细胞数量以及CTLA-4和GITR的表达,RT-PCR方法检测Foxp3 m RNA的表达,ELISA方法检测培养上清中IL-10的含量。结果： 1 Butaprost和L-902,688降低了CD25+Foxp3+细胞的数量和Foxp3m RNA的表达,但是Sulprostone没有任何作用,AH6809和GW627368X均翻转了PGE2引起的Treg细胞数量和Foxp3 m RNA表达的下降。2 PGE2可明显诱导c AMP生成增多和PKA活性增高,Butaprost和L-902,688模拟了PGE2的作用,db-c AMP作为阳性对照,具有相似的作用,该结果被EP2和EP4拮抗剂翻转,AH6809和GW627368X阻断了PGE2的作用。3 db-c AMP模拟了PGE2在Treg细胞分化中的作用,它降低,Treg细胞的数量和Foxp3 m RNA的表达,同时降低Foxp3+CTLA-4+细胞和Foxp3+GITR+细胞的数量,抑制IL-10的生成。而H-89翻转了PGE2对Treg细胞分化和功能的抑制作用,阻断了Butaprost和L-902,688对Treg细胞数量和Foxp3 m RNA表达以及CTLA-4和GITR的表达、IL-10的分泌的影响。4 CCK-8单独作用于Treg细胞,可以上调Treg细胞数量,促进Foxp3m RNA的表达,上调CTLA-4和GITR的表达以及IL-10的分泌,但是仅部分逆转PGE2抑制的Treg细胞分化及CTLA-4和GITR的表达以及IL-10的分泌,并不能完全逆转。小结:以上结果证明PGE2通过EP2/EP4受体和c AMP/PKA通路抑制人初始CD4+T细胞分化为Treg细胞以及Treg细胞CTLA-4和GITR的表达和IL-10的分泌。而CCK-8部分拮抗了PGE2对Treg细胞分化和功能的抑制作用。结论： 本研究使用磁珠分选健康人外周血来源的CD14+单核细胞,体外诱导其分化为i DC和m DC,检测CCK-8对两种状态的DC表型成熟的影响,进而观察了CCK-8调节的DC在Treg细胞功能中的影响,并探索CD80、CD86和GITR-L在DC调节Treg功能中作用以及CCK-8的受体作用机制,得出以下结论:1本实验证实,CCK-8抑制m DC表型,诱导半成熟状态的DC即t DC的生成。CCK-8既可以上调m DC调节的Treg细胞的抑制功能,又可以促进m DC调节的Treg细胞增殖,此作用可能与其诱导t DC的生成有关。2 CCK-8可能通过调节DC表达的CD80/CD86和GITR-L进而对Treg细胞的功能产生影响。CCK-8通过CCK2R抑制m DC表达CD80、CD86和GITR-L,进而对Treg细胞的功能发挥调节作用。CCK-8受体后PKA和PKC通路参与CCK-8调节DC的作用,进而对Treg细胞的功能发挥了调节作用。3 PGE2通过EP2/EP4受体和c AMP/PKA通路抑制人初始CD4+T细胞分化为Treg细胞以及Treg细胞CTLA-4和GITR的表达和IL-10的分泌。而CCK-8部分拮抗了PGE2对Treg细胞分化和功能的抑制作用。