2003年国内某火鸡场发生了一种以侵害15～25日龄雏火鸡为主的急性传染病,临床表现为腹泻,十二指肠、直肠充血和出血,盲肠肿大,肠道内充满黄绿色稀便。死亡率为10%～20%。根据本实验室对其初步的检测,怀疑为火鸡蓝冠病病毒感染疑似病例。为进一步确定,本研究取其临床病料对其病毒进行了分离和初步鉴定。 1、采取病死火鸡肝、脾、肠,以1:5的PBS(含2000单位双抗/mL)稀释后匀浆,4℃作用2h。5 000×g离心20min,取上清液经尿囊腔接种15日龄SPF鸡胚。传至第二代,取感染鸡胚的卵黄和肠道匀浆,用兔血球作血凝试验,血凝价高达2~6。 2、病毒继续传至第五代,分别收集接种后72h内死亡或存活的鸡胚卵黄和肠道。卵黄用2%聚乙二醇除脂处理后,再用10%聚乙二醇沉淀病毒,肠道匀浆经差速离心后,再用10%聚乙二醇沉淀病毒,然后分别将上述两种病毒提纯液进行蔗糖密度梯度离心,收集蔗糖密度在1.156～1.26g/cm~3之间的乳白色条带,再经96 000×g超速离心2h去除蔗糖。取沉淀物负染,经透射电镜观察,在肠道病毒提纯液中见有圆形或椭圆形,带有花冠状纤突,直经约为120nm大小的病毒粒子。 3、取感染鸡胚肠道,提取总RNA,反转录,根据Gene Bank公布的TCV S2基因序列,设计引物进行PCR,结果扩增出了预期大小的DNA片段。 4、用感染鸡胚卵黄经口接种1日龄易感雏火鸡,接种后第3天感染雏火鸡出现精神沉郁、腹泻等症状,死亡率为20%。对照组无任何临床症状。 根据以上结果初步确定所分离病毒为火鸡冠状病毒。