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第一部分二甲双胍对HaCaT细胞增殖信号通路影响研究目的：二甲双胍作为一种胰岛素增敏剂,被广泛应用于Ⅱ型糖尿病的治疗。最近的研究证明,二甲双胍能显著抑制多种肿瘤细胞的生长,包括乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胰腺癌等恶性肿瘤,二甲双胍具有抑制肿瘤细胞增殖的功效。银屑病中存在明显的角质形成细胞增殖和分化的异常,HaCaT细胞具有银屑病皮损处角质形成细胞所表现的过度增殖的特征,该细胞被广泛的用于体外抗银屑病药物的研究模型。本研究从细胞增殖调控角度出发,利用HaCaT细胞研究二甲双胍对细胞增殖以及细胞增殖调控相关蛋白表达的影响,探讨二甲双胍治疗银屑病的可能分子机制,为二甲双胍治疗银屑病提供理论基础。方法：1.培养HaCaT细胞观察二甲双胍对其形态学影响以0、25、50和75mmol/L四种浓度的二甲双胍对HaCaT细胞进行干预,24h后在倒置相差显微镜下观察细胞形态的变化；2.CCK-8比色法检测二甲双胍对HaCaT细胞增殖的影响采用50mmol/L的二甲双胍干预对数生长期的HaCaT细胞,分别于24h、48h和72h收集细胞,利用CCK-8比色法检测细胞的增殖活性；3.Western blot法检测二甲双胍对HaCaT细胞内AMPK、ERK1/2蛋白表达的影响50mmol/L的二甲双胍干预HaCaT细胞,24h后提取细胞总蛋白并对蛋白定量,以Western blot法检测细胞内AMPK、ERK1/2蛋白的磷酸化水平。4.统计学分析结果采用SPSS13.0统计软件分析。所有实验数据结果均取均数±标准差,以(x±s)表示,多组均数比较用单因素方差分析,两组均数比较用t检验,P<0.05表明差异有显著的统计学意义。结果：1.二甲双胍对HaCaT细胞形态学的影响HaCaT细胞经过二甲双胍干预24h以后,Ommol/L组和25mmol/L组在细胞形状和大小上无显著变化,仅表现为粘附性降低,部分细胞脱落、漂浮；50mmol/L组细胞体积稍变小,细胞内颗粒、空泡增多,细胞粘附性变差,有较多细胞从瓶壁脱落,漂浮于培养液中；75mmol/L组细胞全部脱落、漂浮。2.二甲双胍对HaCaT细胞增殖的影响50mmol/L二甲双胍干预后HaCaT细胞的存活率第24h为36.18%、48h为12.70%、72h为10.12%,随着二甲双胍作用时间延长,HaCaT细胞的存活率逐渐下降。3.二甲双胍对HaCaT细胞内AMPK、ERK1/2蛋白表达的影响二甲双胍干预前,HaCaT细胞内检测到的p-AMPK与β-actin的平均吸光度值比值为2.856±0.323,50mmol/L二甲双胍干预后为5.198±0.625,二者比较有显著统计学意义(t=55.376,p=0.00,p<0.05)；二甲双胍干预前,HaCaT细胞内p-ERKl/2与β-actin的平均吸光度值比值为7.550±1.087,50mmol/L二甲双胍干预后为10.430±1.217,二者比较有显著统计学意义(t=12.461,p=0.012,p<0.05),提示二甲双胍干预可导致p-AMPK,p-ERK1／2表达上调。结论：二甲双胍可以显著抑制HaCaT细胞的增殖活性,其抑制率与时间呈正相关,提示二甲双胍可通过激活AMPK,作用于ERK1/2信号传导通路,并作用于下游的靶基因,进而抑制HaCaT细胞的增殖。第二部分二甲双胍对豚鼠耳银屑病模型影响的研究目的：豚鼠耳部银屑病模型能够较好的模拟银屑病皮损部位的典型组织病理改变,本研究通过构建豚鼠耳部银屑病模型,研究二甲双胍对豚鼠耳部银屑病样模型病理改变的影响,探讨二甲双胍在临床治疗银屑病的可行性,并初步探讨其作用机制,为二甲双胍治疗银屑病研究提供初步的数据和资料。方法：3-4周龄Hartley豚鼠50只,随机选取10只为正常对照组,其余40只构建豚鼠耳部的银屑病样病理改变模型,以5%普萘洛尔软膏均匀涂于豚鼠耳背,每日3次,厚度1.Omm,连续4周,造成豚鼠耳部的银屑病样动物模型,设非干预组、生理盐水对照组及50mmol/L二甲双胍组、100mmol/L的二甲双胍组。4周后,分别用生理盐水、50mmol/L二甲双胍、100mmol/L二甲双胍外涂豚鼠耳部造模处,每日三次,连用4周。4周后取豚鼠耳部标本制作组织病理切片。采用Baker法对各组切片组织学积分进行评估并检测二甲双胍干预前后豚鼠耳部表皮的厚度。应用SPSS13.0统计软件对结果进行统计学分析。结果：1.肉眼观察基本情况正常对照组豚鼠精神好,习性温顺,胆小易惊,毛发浓密有光泽,紧贴皮肤,饮食、二便正常。所有造模动物2周后出现搔抓耳部现象,耳背部涂药处毛发部分脱落,部分动物耳背局部皮肤红,毛细血管扩张明显。4周后造模动物上述症状加重并出现搔抓耳部现象。二甲双胍组治疗4周后,豚鼠上述症状明显减轻。2.光镜下观察豚鼠耳背部表皮厚度值测量和Baker法对组织评分造模组镜下可见广泛角化过度及灶性角化不全,部分角化不全部位可见Munro微脓肿；颗粒层变薄或消失；棘层明显肥厚,表皮突下延,真皮乳头上抬；毛细血管扩张、充血,真皮浅层及乳头部可见单一核及多形核细胞浸润,提示造模成功。50mmol/L二甲双胍组、100mmol/L二甲双胍组镜下均可见角化过度及角化不全现象减轻,棘层变薄,皮突不明显,毛细血管扩张和炎症细胞浸润现象改善,未见Munro微脓肿。Baker评分分别为1.25±0.43,1.43±0.25,耳背部表皮厚度值分别为64.98±7.01,61.08±6.09。50mmol/L、100mmol/L二甲双胍组与生理盐水组Baker评分及耳背部表皮厚度值比较均存在显著差异。50mmol/L二甲双胍组、100mmol/L二甲双胍组之间Baker评分及耳背部表皮厚度值比较无显著差异。实验显示,二甲双胍治疗组Baker评分和豚鼠耳部表皮的厚度均出现不同程度下降,与造模后观察组比较有显著的统计学意义,表明二甲双胍可改善豚鼠耳部银屑病样模型的病理变化。结论：二甲双胍可改善豚鼠耳部银屑病样模型的病理变化。其作用机理可能与抑制细胞的过度增殖,抑制炎症因子的释放,减轻局部的炎症反应,减轻局部的血管扩张有关。