毕赤酵母表达系统用于表达异源蛋白已经得到了广泛地应用，目前在毕赤酵母中常用的高效诱导型启动子是AOX1启动子。毕赤酵母中醇氧化酶(Aox)是甲醇代谢过程中的关键酶，其作用是在过氧化物酶体中催化甲醇氧化生成甲醛和过氧化氢。AOX1基因是编码醇氧化酶(Aox)的主要来源，AOX1启动子严格地受甲醇的诱导转录，而在葡萄糖、甘油、果糖等碳源的存在下被抑制。然而该启动子的具体调控机制目前还不是十分明确，需要进行更加深入地研究。　　本课题组前期的研究中，通过同源比对的方法，分别鉴定了毕赤酵母AOX1启动子甲醇诱导相关转录因子编码基因MIT1和PRM1，以及碳源阻遏因子编码基因MIG1、MIG2和NRG1，并通过实验验证了这5个转录因子的调控功能。本文主要对这5个转录因子与AOX1启动子之间的相互作用进行了研究。　　首先在大肠杆菌中异源表达了转录因子Mit1、Prm1、Mig1、Mig2和Nrg1的锌指结构域的重组蛋白(分别命名为Mit1-n150、Prm1-n40-90、Mig1-n150、Mig2-n150和Nrg1-c80)，并通过镍柱亲和层析纯化得到了这些重组蛋白。　　AOX1启动子上有许多顺式调控元件，研究过程中将AOX1启动子的-940～-162 bp区域分成四个DNA片段(分别命名为PAOX1-AB、PAOX1-BC、PAOX1-CD和PAOX1-DE)。在体外实验过程中，选用电泳凝胶迁移阻滞实验(EMSA)研究这些转录因子的异源重组蛋白和AOX1启动子的不同DNA片段之间的相互作用关系。最终发现了转录因子Mit1分别与PAOX1-BC和PAOX1-CD结合，Prm1分别与AOX1-CD和PAOX1-DE结合，Nrg1与PAOX1-AB结合。DNaseⅠ足迹分析检测鉴定了Prm1在AOX1启动子上的结合位点，具体序列是5AAAAGTCGGCATACCGTTTGTCTTGTTTGGTATTGATTGAC3。同时鉴定发现Nrg1在AOX1启动子上有多个结合位点，其碱基序列依次是5TCCACAGG3、5CACACATAAGTGCCA3、5GGAGGGG3和5TCTCCTCAACAC3。　　本研究首次鉴定了毕赤酵母转录因子Prm1和Nrg1在AOX1启动子上的具体结合位点，为AOX1启动子的转录机制的研究提供了较大支持，也对进一步开发非甲醇诱导型毕赤酵母表达系统提供理论依据。