苔藓细胞色素P450及小G蛋白PpRan基因的克隆及分析

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苔藓(P patens)是目前发现的唯一具有高频率同源重组特性的植物。基因打靶技术的核心是同源重组,由于结果的可预见性和准确性,基因打靶已成为功能基因组学研究的常规技术。苔藓(P.patens)生命周期短,易于培养,而且其个体小,易于转化(PEG介导的原生质体转化),再生力极强,有利于高通量规模化培养和突变体筛选。苔藓植物也有世代交替,但其单倍体的配子体世代占优势,这利于快速构建突变体和遗传性状的直接分析。因此,苔藓在整个植物功能基因组学研究中具有代表性。本研究以苔藓(P.patens)为模式系统,对苔藓细胞色素P450和小G蛋白PpRan基因进行了相关研究。   细胞色素P450是一类具有混合功能且含血红素的氧化还原酶。植物细胞色素P450参与多种代谢途径,包括参与植物体的基础代谢和植物次生代谢,植物P450基因功能研究一直倍受国内外科学家重视。本研究克隆了苔藓的4个细胞色素P450基因,利用同源重组技术对这4个P450基因实施定点突变,成功构建了诱导其功能缺失的载体;同时我们将利用P450promoter::cDNA:GFP融合技术研究细胞色素P450的亚细胞定位。根据得到的细胞色素P450基因功能缺失突变体的表型变化及细胞色素P450的亚细胞定位结果来研究P450基因的功能。本研究成功构建了这4个P450基因的功能缺失载体并转化苔藓,已得到CYP73A49基因缺失的苔藓,目前还没有观察到明显的表型变化,需要进一步进行生理生化方面的研究。P450promoter::cDNA::GFP融合蛋白载体的亚细胞定位的研究正在进行中。   Ran是一种大量分布于细胞核内的小分子的GTP酶,在核质运输过程中具有十分重要的作用,而且还参与调控细胞分裂及其信号传导的功能。本研究利用基于同源序列的PCR技术,成功克隆了PpRan基因组序列及cDNA序列,并对苔藓PpRan基因编码的氨基酸保守序列进行了相关分析。利用半定量PCR技术对PpRan基因在苔藓不同组织中以及苔藓受到缺磷胁迫时的表达研究发现:PpRan基因的表达具有组织特异性,茎叶体和原丝体中表达量较高,假根中表达量比较低;PpRan基因受缺磷胁迫诱导表达,随着缺磷胁迫时间的延长表达量越来越高。  
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