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口腔鳞状细胞癌(orals squamous cell carcinoma,OSCC)是一类上皮源性恶性肿瘤,是全身第6位常见的癌症。常见于舌、口底、颊部、牙龈、唇和腭部,其中又以舌部居多。虽然近些年各国学者和临床医生多方努力,不断推动口腔鳞状细胞癌的临床诊断与治疗技术,但术后总体5年生存率无明显提高。在对肿瘤的发生、发展机制的研究中发现,转录因子E2F家族在调控细胞增殖、分化上具有重要的作用。E2F-1是E2F家族8个成员之一,具有癌基因和抑癌基因两种特性,提示E2F-1在肿瘤形成中是起癌基因作用还是起抑癌基因作用取决于两种作用的状态,并与器官特异性有关。在口腔癌前病损及口腔鳞癌组织中E2F-1高表达,且表达水平与患者的预后存在着密切的相关性。RNA干涉(RNA interference,RNAi)是靶向性地干扰mRNA从而抑制相应基因表达的一项革命性技术。通过干扰靶基因的mRNA的表达,可以有效地破环mRNA的作用,达到使该基因“沉默”的目的。本研究结合慢病毒载体介导的靶向E2F-1 mRNA的shRNA片段,干扰舌鳞癌细胞株Tca8113中E2F-1 mRNA的表达,探讨E2F-1 mRNA干扰后pRb/E2F-1通路下游相关基因的表达,以及Tca8113细胞在增殖、凋亡方面的生物学变化,为研究OSCC的发病机制和基因治疗提供理论基础和实验依据。。第一部分E2F-1基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定目的:构建和鉴定靶向E2F-1基因的RNA干扰慢病毒载体。方法:本课题通过Sigma-Aldrich网站设计靶向E2F-1mRNA的3个shRNA片段,根据慢病毒包装系统中的载体所需的酶切位点(Age I/EcoR I),在合成shRNA片段时加上相应的碱基,将shRNA片段连至载体,转化感受态细胞,挑选阳性克隆测序。测序结果与设计一致后,转入E.ColiTop10大量制备含有shRNA片段的pLKO.1-TRC cloning vector质粒和重组慢病毒包装系统中另外2个辅助质粒,即pCMV-dR8、pVSVG,重组E2F-1基因RNAi的慢病毒颗粒。以上述3种E2F-1-shRNA慢病毒颗粒感染舌鳞癌细胞Tca8113。感染完成后,用嘌呤霉素筛选成功感染的Tca8113细胞。PCR、Real time PCR、Western blot检测感染后3组Tca8113细胞中E2F-1的表达情况,筛选出有效的shRNA。结果:shRNA片段连接至载体后,PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳可见特异性条带,说明shRNA片段成功加载至pLKO.1-TRC cloning vector。测序结果与设计一致。3种重组慢病毒颗粒感染Tca8113细胞后,PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳可见E2F1-shRNA-1组条带明显减弱;Real time PCR检测显示E2F-1-shRNA-1组中E2F-1表达水平降低了约70%;Western blot检测显示E2F-1-shRNA-1组中E2F-1在蛋白水平也有明显降低。说明E2F-1-shRNA-1具有明显的干扰效率。结论:靶向E2F-1基因的shRNA慢病毒载体构建成功,并可特异性沉默E2F-1基因的表达,为研究E2F-1在口腔鳞癌发生发展中的作用提供了初步的实验基础。第二部分特异性沉默E2F-1基因对人舌鳞癌细胞株Tca8113细胞的影响及分子机制研究目的:观察E2F-1基因沉默后,人舌鳞癌细胞株Tca8113细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响,并探讨其中的分子机制。方法:培养有效干扰E2F-1表达的Tca8113细胞,通过Real time PCR、Western blot分别从基因水平和蛋白表达水平检测E2F-1、pRb、Cyclin E、p14和p53的表达情况。应用流式细胞术检测细胞周期及凋亡率的改变。MTT检测该细胞增殖的变化。结果:E2F-1-shRNA组Tca8113细胞的MTT检测结果显示:该组细胞较阴性对照组和空白组增值能力降低明显。流式细胞术检测结果显示:E2F-1-shRNA-1组中细胞凋亡的比列明显高于阴性对照组和空白组,具有统计学意义(P<0.05),且其E2F-1-shRNA-1组细胞的细胞周期中G1期比例降低,G2期比例升高,与对照组相比有统计学意义(P<0.05),S期未见明显变化。E2F-1-shRNA-1组细胞中,Cyclin E、p14、p53的表达降低(P<0.05),而Rb未见明显变化。结论:Tca8113细胞中E2F-1水平降低,能够对其增殖具有抑制作用,同时可以诱导细胞发生凋亡,改变Tca8113细胞周期分布。其机制可能与下游增殖(Cyclin E)途径和p14/MDM2/p53凋亡途径相关。提示E2F-1表达下调后Tca8113细胞的变化涉及多基因、多水平调控。