疟疾依然是威胁人类健康的重要热带传染病。据估计全球每年疟疾患病人数为3-5亿,死亡病例在100万以上。感染人类的疟原虫有四种,其中恶性疟原虫致病最为严重,可引发重型疟疾包括脑型疟和妊娠相关疟疾。目前,我国恶性疟病例主要集中在云南和海南两省,流行趋势并无减弱之势；加之我国西南边境人口流动频繁及中非交流合作加强,陆续有“输入性疟疾”病例报道。在国际上,对不同地区的恶性疟原虫种群结构和遗传进化开展了广泛的研究,这些研究已基本阐明全球其他地区恶性疟原虫虫株的遗传变异特点,对全球疟疾防治工作发挥重要的理论指导作用。然而,迄今对我国疟原虫种群结构等相关研究尚未系统展开,与国际上其它地区相比,目前尚缺乏我国不同地区疟原虫种群结构与基因多样性遗传数据库。对此,本课题通过检测恶性疟原虫不同染色体上的微卫星分子标记,对我国不同地区恶性疟原虫进行种群结构相关研究,旨在寻找和确定具有地区差异性的分子遗传标记,为建立我国恶性疟原虫遗传数据库和恶性疟原虫溯源检测技术提供理论基础。　　 我们从云南和海南两省不同流行地区采集恶性疟疾患者血样本。云南地区样本采集地区按照地理分布主要分为三个区域:(1)怒江流域:流行区包括德宏自治州和中缅边界区域,样本来源为腾冲县、龙陵县、德宏自治州及与缅甸接壤地区包括境外的缅甸克钦邦拉咱地区。(2)澜沧江流域:流行区包括临沧地区、思茅地区及西双版纳傣族自治州,样本来源为西双版纳傣族自治州的景洪市和勐腊县。(3)红河流域:流行区包括红河自治州和文山自治州,样本来源为红河州红河县及元江县。在云南地区共采集疟疾患者血样本共341份。海南地区样本采集地包括三亚市,乐东县和东方市三个地区,采集样本数共计139份。所有样本均采用试剂盒提取基因组DNA。参考目前国际广泛应用于地理株种群结构和遗传多样性研究的工具和方法,选择恶性疟基因组不同染色体上的12个微卫星位点(MSs)对我国恶型疟原虫进行种群结构分析及遗传多样性研究。这些微卫星位点包括TA1、Polyα、PK2、TA81、TA109、TA42、TA40、TA60、ARA2、G377、2490和TA87,均为3个碱基重复类型。每个MS位点设计3条引物,其中1条为荧光标记引物。采用半巢氏PCR方法扩增每个微卫星位点,第二轮PCR采用荧光标记引物,将PCR产物进行GENESCAN检测。检测得到不同的片段长度,代表微卫星等位基因的不同类型。根据每个位点上检测到的等位基因的类型和数目,对各地区感染样本进行多重感染的分析。依据所要检测的微卫星位点变异特征,结合本课题实际情况,确定了区分单一感染和混合感染样本的标准,即:在12个微卫星位点中,若单一等位基因的位点大于或等于9个,则定义为单一感染样本；若单一等位基因的位点少于9个,则定义为多重感染样本。按此标准,六个地区的多重感染样本的百分数为:云南怒江流域24.1％,云南澜沧江流域12.2%,云南红河流域为7.7%,海南三亚为4.3%,海南乐东为10.3%以及东方市为10.9%。分析各地区样本的种群结构时,需要排除多重感染样本,将每个地区单一感染样本数据进行统计。首先分析和计算出各地区样本在每个位点的等位基因类型和频率,将各位点数据输入软件计算等位基因数目和期望杂合度,计算遗传距离,并分析进化关系。　　 本实验中六个采集地区的样本在种群结构及遗传多样性方面显示出差异。从12个微卫星位点检测结果来看,云南三个采集地结果分别为:怒江流域样本平均的等位基因数目为7.833±0.878,平均期望杂合度为0.680±0.059；澜沧江流域样本平均等位基因数目为5.083±0.668,平均期望杂合度为0.672±0.057；红河地区样本平均等位基因数目为3.000±0.461,平均期望杂合度为0.527±0.074；海南三个采集地样本结果分别为:三亚地区样本平均等位基因数目为4.000±0.492,平均期望杂合度为0.582±0.083；乐东县样本平均等位基因数为4.250±0.592,平均期望杂合度为0.588±0.067；东方市样本平均等位基因数为5.250±0.676,平均期望杂合度为0.619±0.061。遗传距离计算及种群进化关系分析显示,所有样本分成两大群体,云南三个地区样本为一个群体,海南三个地区样本则为另一个群体。这与云南海南两省的地理位置情况相一致。　　 通过对所有样本的12个微卫星位点的分析,进一步筛选出具有地区差异性分布的位点,用于溯源检测技术。首先根据先前进化关系分析,将云南三个采集地区合并为一个大的群体,同理将海南三个地区样本合并,将样本分为云南和海南两个群体进行比较。依据云南与海南样本在每个位点等位基因类型和频率统计结果,发现在Polyα、ARA2和TA87这三个位点上,两群体的等位基因类型呈现明显差异的数目多于其他位点。将海南样本按照Polyα-ARA2-TA87位点依次逐步分类,得到海南样本的候选微卫星单体型为Polyα(184/187bp)-ARA2(69bp)-TA87(102bp)；同理将云南样本依照Polyα-TA87-ARA2位点顺序逐步分类,得到云南样本的候选微卫星单体型为Polyα(166/175/178bp)-TA87(72bp)-ARA2(96/105bp)。随后在本实验单一感染样本中随机抽取100例样本,其中海南48例,云南52例。对照这些样本在三个微卫星位点类型,用得出的地区特异性单体型判断每个样本可能的来源地,再与该样本实际采集地作比较看是否结果一致。最后这100例样本中总的一致率达92%,其中海南样本的一致率为93.8%,云南样本一致率为90.4%。通过此结果可以初步验证,本实验分析推断两个群体候选单体型的过程可行,得到的两个候选单体型作为地区特异的疟原虫遗传标识,对溯源检测技术具有应用价值。但是仍需要大量实验性检验来进一步验证本实验得出的判断方法的准确率。　　 本研究运用微卫星位点对我国恶性疟原虫地理株进行了种群结构研究和遗传多样性分析,为建立我国恶性疟原虫群体遗传数据库提供了重要数据。本研究还鉴定了3个具有地区特异性微卫星标志作为候选单体型,为建立我国恶性疟原虫溯源检测技术提供重要的理论依据,有助于实现对我国疟疾疫区恶性疟原虫的动态监测。