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第一部分实验性自身免疫性心肌炎小鼠肠道菌群组成分析目的分析和比较实验性自身免疫性心肌炎小鼠与正常小鼠之间肠道菌群的组成分差异。方法使用6-8周龄,18-20g的雄性BALB/c小鼠。用小鼠α-心肌肌球蛋白重链(MyHC-α)序列(MyHC-α614–629:acetyl-SLKLMATLFSTYAS)进行诱导构建实验性自身免疫性心肌炎(EAM)小鼠模型。实验动物随机分为两组(正常对照组和EAM组)。于初次免疫后第21天收集两组小鼠心脏、脾脏和粪便标本,观察两组小鼠心脏和脾脏大体观。心脏组织行HE染色和总RNA提取。同时提取粪便DNA,采用16Sr RNA测序,分析和比较两组小鼠肠道菌群的差异。结果1.自身免疫性心肌炎小鼠体重明显低于正常小鼠(24.74±0.67 vs.20.89±1.27,P=0.015)。心肌炎小鼠心脏和脾脏较正常小鼠质量均明显增加。HE切片可见心肌炎小鼠心脏组织中大量炎性细胞浸润,而正常小鼠心脏组织中未见炎性细胞。心脏组织PCR结果发现,TNF-α、IL-1β和MCP-1炎性因子mRNA水平在心肌炎小鼠心脏组织中表达明显升高。这些结果提示MyHC-α诱导自身免疫性心肌炎造模成功。2.实验性自身免疫性心肌炎小鼠肠道菌群构成发生明显变化。与正常小鼠比较,实验性自身免疫性心肌炎小鼠肠道菌群在Phylum-Class-Order-Family-Genus各水平均有物种差异。对比正常小鼠肠道菌群,实验性自身免疫性心肌炎小鼠肠道菌群在Phylum水平上主要表现为Bacteroidetes(P=0.018)减少和Firmicutes(P=0.036)增多;在Class水平上主要表现为Bacteroidia(P=0.007)减少和Epsilonproteobacteria(P=0.005)、Clostridia(P=0.037)增多;在Order水平上主要表现为Bifidobacteriales(P=0.021)、Bacteroidales(P=0.009)减少和Lactobacillales(P=0.044)、Clostridiales(P=0.032)和Campylobacterales(P=0.009)增多;在Family水平上主要表现为Bifidobacteriaceae(P=0.028)减少和Helicobacteraceae(P=0.010)、Lactobacillaceae(P=0.020)及Streptococcaceae(P=0.027)等增多;在Genue水平上主要表现为Bifidobacterium(P=0.026)减少和Parabacteroides(P=0.047)、Lactobacillus(P=0.021)、Lachnospira(P=0.045)、Roseburia(P=0.049)、Ruminococcus(P=0.016)、Flexispira(P=0.007)、Helicobacter(P=0.029)等增多。3.衡量肠道菌群紊乱的F/B比值(Firmicutes/Bacteroidetes)在实验性自身免疫性心肌炎组中升高(≈2倍正常组)(P<0.05)。4.实验性自身免疫性心肌炎小鼠肠道菌群丰富度和多样性指标Observed species、Chao、Shannon和Ace较正常小鼠升高,其中Shannon指数差异有统计学意义(P=0.0095)。5.Uni Frac分析显示正常组和实验性自身免疫性心肌炎组肠道微生物组成不同。6.LEf Se分析比较。通过LEf Se分析可见实验性自身免疫性心肌炎小鼠组中有12个分类群的相对丰度比正常组增加,同时4个的分类群相对丰度比正常组减少。7.进一步用PICRUSt预测微生物群落功能。我们通过预测发现了29个显著差异的功能通路,这些功能差异分析为后续进一步的实验提供了思路。结论对比正常小鼠,实验性自身免疫性心肌炎小鼠肠道菌群的组成分明显改变。主要表现在门水平上拟杆菌属比例减少和厚壁杆菌属比例增多,且F/B比值升高。同时心肌炎小鼠肠道菌群多样性较正常小鼠增高。这些结果表明心肌炎小鼠存在肠道菌群紊乱。第二部分粪菌移植对实验性自身免疫性心肌炎小鼠的作用研究目的探讨粪菌移植对实验性自身免疫性心肌炎小鼠的作用及其可能机制。方法使用6-8周龄,18-20g的雄性BALB/c小鼠。用小鼠α-心肌肌球蛋白重链(MyHC-α)序列(MyHC-α614–629:acetyl-SLKLMATLFSTYAS)进行诱导构建实验性自身免疫性心肌炎(EAM)小鼠模型。实验动物随机分为三组:1.正常对照组,2.实验性自身免疫性心肌炎组(EAM组),3.粪菌移植组(EAM+FMT组)。从正常小鼠粪便标本中提取肠道菌群,给予粪菌移植组小鼠灌胃200ul/次,每周3次,共2周。每日记录各组小鼠体重。于初次免疫后第21天各组小鼠行心脏超声检查。收集各组小鼠外周血、心脏、脾脏等标本。心脏HE和组化染色;Real-time PCR检测心脏IFN-γ、IL-4及IL-17A表达;流式细胞学检测外周血、心脏和脾脏中Th1、Th2、Th17及Tregs的细胞比例。结果1.EAM组和粪菌移植组小鼠体重低于正常对照组,但EAM组和粪菌移植组两组小鼠体重无明显差异;粪菌移植组小鼠心脏重量轻于EAM组,心脏/体重比值在粪菌移植组降低。2.小鼠心脏超声结果显示:与正常对照组小鼠相比,EAM组小鼠心功能变化明显,EF%和FS%均明显降低;EAM+FMT组小鼠心功能较EAM组略有改善,EF%和FS%均较EAM组升高,但未达到统计学差异。3.心脏HE染色可见粪菌移植组炎性细胞浸润范围减少、炎症评分降低和细胞坏死面积减少。免疫组化显示,心肌组织中CD3(T细胞)和CD68(巨噬细胞)阳性细胞在粪菌移植组减少。4.心脏组织Real-time PCR检测显示,较之EAM组,粪菌移植组心肌内IFN-γmRNA表达水平明显降低,而IL-4及IL-17AmRNA表达水平两组间无统计学差异。5.流式细胞学检测显示:对比EAM组,粪菌移植组脾脏和心脏内CD4~+IFN-γ~+细胞比例降低,P<0.05;两组间CD4~+IL-17~+细胞在外周血、脾脏和心脏中比例均无明显差异;对比EAM组,粪菌移植组脾脏和心脏内CD4~+IL-4~+细胞略有增高,但未达到统计学差异;6.流式细胞学检测显示:与正常对照组比较,EAM组外周血和脾脏中CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg细胞比例降低,其中脾脏中Treg比例降低达到统计学意义;而粪菌移植组外周血和脾脏中CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg细胞比例较EAM组升高,其中其中脾脏中Treg比例增高达到统计学意义,P<0.05;心脏中CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg细胞比例在三组之间无明显差异。结论粪菌移植能一定程度上改善心肌炎小鼠炎症反应,主要表现在减少心肌中炎性细胞浸润和部分改善心功能。其可能的机制为减少了脾脏和心脏中CD4~+IFN-γ~+细胞比例并上调了脾脏中CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg比例。第三部分粪菌移植后实验性自身免疫性小鼠肠道菌群组成分析目的分析粪菌移植后实验性自身免疫性心肌炎小鼠肠道菌群组成的改变。方法使用6-8周龄,18-20g的雄性BALB/c小鼠。用小鼠α-心肌肌球蛋白重链(MyHC-α)序列(MyHC-α614–629:acetyl-SLKLMATLFSTYAS)进行诱导构建实验性自身免疫性心肌炎(EAM)小鼠模型。实验动物随机分为两组:1.实验性自身免疫性心肌炎组(EAM组),2.粪菌移植组(EAM+FMT组)。从正常小鼠粪便标本中提取菌群,给予粪菌移植组小鼠灌胃200ul/次,每周3次,共2周。于初次免疫后第21天收集两组小鼠粪便标本,提取粪便DNA,采用16Sr RNA测序,比较两组小鼠肠道菌群的组成差异,观察粪菌移植对心肌炎小鼠肠道菌群的改变。结果1.EAM组和EAM+FMT组两组小鼠肠道菌群组成分在不同水平上均有差异。其具体表现在:Phylum水平上EAM+FMT组中Bacteroidetes的比例相对升高,且与EAM组比较有统计学差异(P=0.0276)。同时Firmicutes比例较EAM组略降低(P=0.6868)。EAM+FMT组的F/B比值降低,尽管两组之间的差异没有达到显着性(P=0.0744)。在Class水平上,EAM+FMT组中Bacteroidia比例较EAM组增多(P=0.033),而Clostridia比例较EAM组略有下降(P=0.67)。同时,我们观察到Deferribacteres在EAM+FMT组明显下降(P=0.026);在Order水平上,EAM+FMT组中Bacteroidales比例较EAM上升(P=0.03),而Clostridiales、Lactobacillales和Campylobacterales比例在EAM+FMT组均不同程度减少,其中Campylobacterales比例两组间差异存在统计学意义(P<0.05);在Family水平上,EAM+FMT组中Helicobacteraceae和Lactobacillaceae比例较EAM组下降(P值分别为P=0.035和P=0.66),同时,我们发现Prophyromonadaceae比例在EAM+FMT组下降(P=0.02);在Genue水平上,EAM+FMT组中Parabacteroides比例较EAM组略有下降,而Flexispira和Ruminococcus比例在EAM+FMT组增加,但均未达到统计学差异。2.我们发现FMT干预后没有进一步增加心肌炎小鼠肠道菌群的丰富度和多样性。相反与EAM组相比,在EAM+FMT组中观察到Shannon指数降低的趋势。在主成分分析中,我们观察到两个组的肠道菌群集群间较明显的分离,说明EAM组和EAM+FMT组两组肠道微生物组成有差别。结论粪菌移植治疗后提高了心肌炎小鼠肠道内拟杆菌属的比例和降低了厚壁杆菌属的比例,同时降低了F/B比值。同时部分恢复了肠道菌群的多样性。这些结果说明了粪菌移植可以重塑心肌炎小鼠体内紊乱的肠道菌群。