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根结线虫是辣(甜)椒的主要病害之一,其危害日趋严重。培育抗性品种是防治根结线虫最有效的方法,常规育种周期长、消耗大,利用分子标记辅助育种则会大大提高育种速度。EST-SSR作为一种新型分子标记,来自表达基因,除具备传统基因组来源的SSR标记所有优势外,还可能与基因功能具有直接或间接关系,从而强化了SSR标记在遗传研究中的应用。
本研究以辣椒EST数据为基础,通过分析辣椒EST-SSR位点信息,建立了部分辣椒EST-SSR标记,并开发与辣椒抗根结线虫显性单基因Me1紧密连锁的分子标记,为Me1基因的标记辅助选择奠定基础。主要研究结果如下:
1.利用SSRIT软件(http://www.gramene.org/gremene/searches/ ssrtool)从NCBl(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST)数据库中19173条辣椒EST序列中筛选到612个SSR,检出率为3.19%。共观察到51种重复基元,其中三核苷酸基序是主导类型,占总SSR的60.46%:AG/GA/CT/TC,AAG/AGA/GAA/CTT/TTC/TCT,TAAT,ATATA和CTGCTC分别是二、三、四、五和六核苷酸基序的优势重复基序,在所有SSR中的出现频率各自为13.40%、16.18%、1.80%、3.27%及2.12%。辣椒EST-SSR以5-10次重复为主,基序长度集中在15-20bp范围内。
2.利用筛选出含SSR的576条EST序列,设计了357对引物,在合适的PCR条件下,利用非变性聚丙烯酰胺凝胶银染检测这些引物在6个辣(甜)椒品种中的扩增情况和多态性。其中有337对引物显示出清晰条带,引物有效扩增率为94.40%;75对引物表现多态性,占有效扩增引物的21.01%。
3.用含抗根结线虫病基因Me1的PM217与典型感线虫品种茄门,及其F1、F2代为试材,采用南方根结线虫(Meloidogyne spp.)人工接种鉴定,每株接种2000卵,两个月后进行抗病性鉴定,根据鉴定结果,利用分离群体分组分析法(bulked segregantanalysis,BSA)建立抗感池,共筛选到4对(118、141、142及211)多态性EST-SSR引物在抗感池间存在差异,分别将该4个标记位点暂命名为118、141、142及211。
4.利用Joinmap3.0软件,结合抗病性鉴定,对271个单株的F2群体进行SSR分析,研究4个EST-SSR标记位点与根结线虫抗性基因Mel的连锁关系,结果表明,EST-SSR标记141、118及211与Mel连锁程度较高,遗传距离分别为6.984cM、18.684 cM和29.310cM。