白腐菌Trametes sp.SQ01染料脱色及其相关木质素酶的研究

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白腐菌是一种作用于木质类结构,专门用于降解木质素、纤维素、半纤维等多糖类物质的真菌,多数是担子菌,少数是子囊菌。白腐菌对木质素和许多异生物质的降解,依赖一些酶的产生和分泌,这些酶共同构成了木质素降解系统。这一酶系统主要由3种酶组成:木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶。白腐菌所具有的特殊的生理生化机制及强大的降解代谢能力,使之成为生物资源再利用和环境保护方面的宝贵资源。  本实验室筛选到一株产生漆酶和锰过氧化物酶的白腐真菌SQ01,通过形态学方法及rDNA序列比对法将其鉴定为担子菌亚门,无隔担子菌亚纲,无褶菌目,多孔菌科,栓菌属,命名为Trametes.sp.SQ01。应用单因素法对发酵培养基进行了优化,该菌株在液体振荡培养条件下,含浓度为0.028mmol/L Cu2+,C/N是5,初始pH值是5.0时产漆酶活力最大。  通过丙酮沉淀和DEAE-cellulose DE52柱层析,快速、有效地纯化了漆酶和锰过氧化物酶。纯化的漆酶并不像传统漆酶那样呈现蓝色,而是一种黄色蛋白。SDS-PAGE分析表明该酶已达到电泳纯,分子量为62kD。以ABTS为底物时,该酶催化反应的最适pH和温度分别是pH4.5和70℃,Km为0.029mmol/L。T.sp.SQ01漆酶在pH3.0~11.0酶活相对稳定,在pH5.0时最为稳定,是目前报道的pH稳定性最好的漆酶。低浓度的金属离子(1mmol/L) Cu2+、Mg2+、Ca2+和Co2+对漆酶有促进作用,而高浓度(5mmol/L)的Co2+、Zn2+、Mn2+、Mg2+却抑制漆酶酶活。SDS对该酶有激活作用,当其浓度为1mmol/L时,漆酶相对酶活达到128%。DTT对漆酶强烈抑制,即使是浓度为1mmol/L,亦可完全抑制漆酶酶活。  采用和漆酶一样的纯化方法,纯化了锰过氧化物酶。纯化的MnP分子量为45 kD,在406nm有特征吸收峰,即索瑞峰。该酶以Mn2+为底物时,最适反应温度和pH值分别为70℃和4.5。pH7.0的T.sp.SQ01 MnP溶液在25℃~50℃保温30min剩余酶活在77%以上,在pH3.0~8.0范围内相对稳定,剩余酶活50%以上,pH4.0~6.0条件下25℃保温12hMnp酶活比处理前提高约16%~30%。对锰过氧化物酶的底物特异性研究表明,当MnP以Mn2+作底物时Km值是30μM;以H2O2作底物时Km值最小,是3.7μM,说明H2O2是所试底物中,锰过氧化物酶的最适宜底物。考察了MnP对H2O2的耐受性,得出该酶对H2O2有一定的抗性。  鉴于白腐菌及分泌酶对染料的独特降解机理,选择3类11种常见染料用于脱色降解实验。结果表明,T.sp.SQ01能脱色降解所有试验染料,但是不同结构染料的脱色存在一定的差异。亮兰和溴酚蓝在7天内可被完全降解,除酸性红以外的偶氮类染料次之,脱色率达97%~99%。菌体单独培养时间越长,反应体系的脱色降解效果越好。纯化的漆酶和Mnp对葸醌类、偶氮类染料表现出较强脱色能力。漆酶对亮兰(100mg/L)的脱色能力显著,0.5U/ml的漆酶在10min内即可达到80%的脱色率,最适反应酶液量是1U/mL,最适pH4.5,最适温度是50℃和60℃。锰过氧化物酶的脱色能力较漆酶稍差,与亮兰、结晶紫等反应24h,脱色率可达70%以上,对其余几种染料也有不同程度的脱色。白腐菌T.sp.SQ01及其分泌酶的高效脱色能力表明该真菌在染料脱色降解方面有着广阔的应用前景,本实验为其在染料废水方面的应用奠定了一定的基础。
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