目的:建立 DNA连接酶与 DNA聚合酶耦联的核酸识别体系以及该体系在HIV基因检测中的应用初探。　　方法:选取HIV-1 pol基因保守区长度为190bp的一段序列作为检测的靶序列。设计三条长DNA序列A、B、C,A、B、C互为模板进行扩增,从而合成所需 HIV模板。分别设计上下游内侧半引物与外侧半引物,运用连接酶与聚合酶耦联核酸识别体系检测有无 HIV模板。本实验首先进行了半引物长度的探索性研究,然后研究了连接酶缓冲液浓度对DNA聚合酶工作效率的影响,并选取最适浓度,从而优化该核酸识别体系。利用连接酶对半引物进行连接反应,然后将连接产物加入到TaqDNA聚合酶介导的PCR体系中,与未加该产物而只加入内侧半引物、只加入外侧半引物、以及内外侧半引物均加入而不加连接酶的反应体系进行比较,分析连接酶对半引物的连接作用有无,以及连接后是否扩增。比较研究PfuDNA聚合酶介导的PCR体系中,内外侧引物的连接缺口处,配对与不配对情况下耦连识别体系的工作效率。本实验还将正常人基因组DNA加入反应体系中,以检测引物特异性,以EGFR基因作为阳性对照,观察该耦联体系的检测作用研究该耦联核酸识别体系的工作效率和灵敏度。　　结果:用三条人工合成长DNA序列A、B、C互为模板互为引物的方法,在55℃的退火温度下方便快捷的合成了检测模板。分别利用三对外侧引物对(HF-1,HR-1;HF-2,HR-2;HF-3,HR-3)以及三对内侧引物对(HFP-1,HRP-1;HFP-2,HRP-2;HFP-3,HRP-3)进行扩增反应,较长的HF-1,HR-1;HFP-1,HRP-1;HFP-2,HRP-2均可单独生成产物,较短的内侧半引物对HFP-3,HRP-3与外侧半引物对HF-2,HR-2;HF-3,HR-3不能单独生成产物。在25μl PCR反应体系中,加入0-1μl的10×连接酶缓冲液,得到DNA连接酶缓冲液与DNA聚合酶缓冲液不同浓度比例的反应体系,实验结果表明,未加连接酶缓冲液的体系反应良好,含0.1μl至0.25μl连接酶缓冲液的体系扩增反应依次减弱,当加入0.5μl或更多时,扩增反应被完全抑制,没有产物。而PfuDNA聚合酶介导引物延伸反应中加入0.1μl的体系反应减弱,当加入0.25μl时反应几乎完全被抑制,加入0.5μl或更多时,扩增反应被完全抑制,没有产物。运用上述优化的引物HF-3,HR-3;HFP-3,HRP-3以及优化的缓冲液比例,在53℃、57℃、61℃、64℃四个温度梯度下进行反应,结果在57℃及其更高退火温度下,只加入内侧半引物、只加入外侧半引物、以及内外侧半引物均加入的体系中均没有出现产物,而加入连接反应产物的反应体系均能扩增出目的产物。在PfuDNA聚合酶介导的PCR反应体系中,较高和较低两种退火温度下,缺口不配对时均没有产物,而配对时,均有产物出现。当在反应体系中加入正常人基因组 DNA,并以 EGFR基因作为阳性对照时,加入连接酶的体系中出现目的产物,而未加连接酶的体系中没有产物。　　结论:　　(1)连接酶反应缓冲液对聚合酶的效率有一定抑制作用。　　(2)内侧半引物与外侧半引物与模板互补的部分的长度对该耦连核酸分子识别体系特异性是非常关键的。　　(3)利用连接酶与聚合酶耦联的核酸识别体系进行基因检测可以采用两步法。　　(4)连接酶与聚合酶耦联的核酸识别体系可以用于建立一种更高特异性的HIV基因检测方法。