论文部分内容阅读
目的: 肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)是一种罕见的神经系统疾病，表现为肌无力、肌萎缩，伴构音障碍、吞咽困难等，最终呼吸衰竭，目前缺乏特效治疗方法。本研究拟采用hSOD1-G93A转基因小鼠，给予不同浓度健脾益肺方灌胃处理，并通过评估其体重变化、运动功能、生存期等指标观察健脾益肺方的疗效;应用组织免疫荧光，检测腰段脊髓前角神经元核蛋白(Neuronal Nuclei，NeuN)、小胶质细胞特异性标志物整合素α M(CD11b)及核转录因子NF-κ B p65的荧光情况，初步探讨健脾益肺方对ALS模型小鼠小胶质细胞活化调控作用及相关机制。 方法: 1.将hSOD1-G93A转基因小鼠随机分为:生理盐水组、低浓度健脾益肺方组、中浓度健脾益肺方组和高浓度健脾益肺方组;同窝普通野生型小鼠设为阴性对照组。每组小鼠6只。模型小鼠按分组予生理盐水或对应浓度健脾益肺方灌胃，阴性对照组予等量生理盐水灌胃。每日灌胃一次。 2.测定小鼠体重，通过Weydt评分确定发病时间及生存期，通过悬尾试验、衣架悬挂试验、疲劳转棒试验等评价运动功能。统计分析各组间差异。 3.各组小鼠终末期经取材、固定、冰冻切片后，进行免疫荧光染色。正置荧光显微镜×40倍物镜下观察并拍照。利用Image J软件测定前角NeuN阳性细胞计数、CD11b阳性活化小胶质细胞计数及NF-κ B p65荧光强度核/浆比。统计分析各组间差异。 结果: 1.体重变化 治疗前，生理盐水组和低浓度、中浓度、高浓度健脾益肺方组模型小鼠体重差异没有统计学意义(P＞0.05)。治疗后，前期四组模型小鼠的体重随时间均呈增加趋势，增加幅度基本无差异。16周龄开始，各组体重差异具有统计学意义(P＜0.01)。与生理盐水组模型小鼠比较，低浓度健脾益肺方组体重差异无统计学意义(P＞0.05);中浓度、高浓度健脾益肺方组模型小鼠体重下降幅度明显延缓，差异具有统计学意义(P＜0.05、P＜0.01)。 2.发病期和生存期 生理盐水组和低浓度、中浓度、高浓度健脾益肺方组模型小鼠的发病时间依次为:(88.83±4.12)天、(101.33±5.75)天、(108.83±6.68)天、(113.50±10.74)天。与生理盐水组比较，低浓度健脾益肺方组发病时间没有明显差异，中浓度和高浓度健脾益肺方组模型小鼠的发病时间明显延迟，差异具有统计学意义(P=0.986、0.035、0.001)。生理盐水组和低浓度、中浓度、高浓度健脾益肺方组模型小鼠的生存期依次为:(125.17±3.71)天、(132.17±2.93)天、(138.50±5.05)天、(143.83±3.97)天。与生理盐水组比较，低浓度、中浓度和高浓度健脾益肺方组的生存期显著延长，差异具有统计学意义(P=0.017、0.000、0.000)。 3.运动功能: 衣架悬挂试验:9-14周龄，生理盐水组和低浓度、中浓度、高浓度健脾益肺方组模型小鼠掉落次数处于低水平的稳定状态，各组没有明显差异。15-16周龄，生理盐水组掉落次数迅速增多，同时期健脾益肺方组情况基本稳定。17周龄开始，生理盐水组模型小鼠不能耐受试验，健脾益肺方组掉落次数迅速增多。与生理盐水组模型小鼠比较，低浓度、中浓度、高浓度健脾益肺方组掉落次数减少，差异具有统计学意义(均P＜0.01)。 疲劳转棒试验:9-13周龄，生理盐水组和低浓度、中浓度、高浓度健脾益肺方组模型小鼠掉落次数处于低水平的稳定状态，各组没有明显差异。14-17周龄，生理盐水组掉落次数迅速增多，同时期，健脾益肺方组模型小鼠情况基本稳定。18周龄开始，生理盐水组模型小鼠不能耐受试验，同时期的健脾益肺方组掉落次数迅速增多。与生理盐水组模型小鼠比较，低浓度、中浓度、高浓度健脾益肺方组掉落次数减少，差异具有统计学意义(P＜0.05)。 4.NeuN阳性细胞计数 生理盐水组和低浓度、中浓度、高浓度健脾益肺方组模型小鼠依次为:(3.83±0.98)个/视野、(4.17±1.17)个/视野、(4.83±1.17)个/视野、(7.83±1.17)个/视野。阴性对照组为:(9.17±0.75)个/视野。与阴性对照组比较，生理盐水组模型小鼠前角NeuN阳性细胞计数明显减少，差异具有统计学意义(P＜0.01)。与生理盐水组模型小鼠比较，低浓度、中浓度健脾益肺方组模型小鼠的NeuN阳性细胞计数差异无统计学意义，而高浓度组明显增多，差异有显著统计学意义(P＜0.01)。 5.CD11b免疫荧光表达 激活型小胶质细胞计数:生理盐水组和低浓度、中浓度、高浓度健脾益肺方组模型小鼠的CD11b阳性细胞表现为胞体呈不同程度地增大，细胞突起增粗、变短，呈激活的小胶质细胞。CD11b阳性细胞激活型小胶质细胞计数依次为:(17.50±1.05)个/视野、(15.00±1.41)个/视野、(12.33±1.63)个/视野、(9.17±1.47)个/视野。阴性对照组为:(0.33±0.52)个/视野。与阴性对照组比较，生理盐水组模型小鼠激活型小胶质细胞计数明显增多，差异具有统计学意义(P＜0.01)。与生理盐水组模型小鼠比较，低浓度、中浓度和高浓度健脾益肺方组模型小鼠的CD11b阳性激活型小胶质细胞计数显著减少，差异有显著统计学意义(P＜0.05、P＜0.01、P＜0.01)。 激活型小胶质细胞占比:生理盐水组和低浓度、中浓度、高浓度健脾益肺方组模型小鼠的CD11b阳性细胞中激活型小胶质细胞占小胶质细胞总计数比值依次为:(19.15±1.67)％、(16.67±1.76)％、(13.35±1.61)％、(10.05±1.80)％。阴性对照组为:(0.35±0.55)％。与阴性对照组比较，生理盐水组模型小鼠的激活型小胶质细胞占比明显升高，差异具有统计学意义(P＜0.01)。与生理盐水组模型小鼠比较，低浓度健脾益肺方组模型小鼠无明显差异(P=0.052)，而中浓度、高浓度健脾益肺方组激活型小胶质细胞占比明显下降，差异具有统计学意义（均P＜0.01）。 6.NF-κB p65免疫荧光强度核/浆比 生理盐水组和低浓度、中浓度、高浓度健脾益肺方组模型小鼠依次为:(1.389±0.035)％、(1.394±0.020)％、(1.211±0.059)％、(1.206±0.056)％。阴性对照组为:(20.42±5.10)％。与阴性对照组比较，生理盐水组模型小鼠的p65荧光强度核/浆比明显升高，差异具有统计学意义(P＜0.01)。与生理盐水组模型小鼠比较，低浓度健脾益肺方组无明显差异(P=0.995)，中浓度和高浓度健脾益肺方组均明显下降，差异有统计学意义（均P＜0.01）。 结论: 1.hSOD1-G93A转基因小鼠发病后体重下降严重，运动功能减退，生存期缩短;健脾益肺方治疗hSOD1-G93A转基因小鼠能延缓发病时间，延长生存期，保持体重，改善运动功能。 2.hSOD1-G93A转基因小鼠发病后存在腰段脊髓前角神经细胞丢失、小胶质细胞活化增生和NF-κ B p65核转移程度增高;高浓度健脾益肺方能减轻模型小鼠脊髓神经元丢失情况;中、高浓度健脾益肺方能抑制模型小鼠脊髓小胶质细胞活化，抑制NF-κB p65核转移过程。 3.健脾益肺方的作用靶点可能是通过抑制NF-κB信号通路，减少小胶质细胞活化，从而发挥抗神经炎症的作用，减少神经元损害和丢失，延缓疾病进展。