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目的:糖尿病(Diabetes mellitus,DM)是因遗传和坏境因素共同作用而引起的高血糖以及碳水化合物、脂肪和蛋白质等代谢失衡的慢性疾病。它不仅引起糖代谢紊乱,而且引起血管病变。内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells,EPCs)在维持血管健康和促进受损血管的重建过程中起着重要作用。当前,在糖尿病血管新生受损的机制研究中,EPCs功能失调相关因素已经受到广泛重视,其中,氧化应激与EPCs功能失调关系密切。已有研究表明:糖尿病患者的高血糖环境可以使EPCs凋亡增多,数量减少,而且凋亡增加可能是糖尿病血管病变中EPCs减少的主要机制。细胞凋亡是由基因控制的一种自主性、程序性的死亡过程,它可以由多种刺激因素引起并且主要通过死亡受体介导的途径介导凋亡,在死亡受体介导的凋亡途径中,肿瘤坏死因子受体(Tumor necrosis factor receptor,TNFR)是当前研究发现的最大的死亡受体家族,其凋亡信号传递过程中,主要是由TNFR1介导的。有研究报道高糖能诱导EPCs中TNFR1表达,这种效应能被抗氧化剂抑制。因此,本实验主要通过观察体外高糖是否通过氧化应激反应激活TNFR1及其下游的凋亡信号通路,进而对大鼠骨髓源性EPCs凋亡产生影响,来探讨高糖对EPCs的作用和影响。方法:用颈部脱臼法处死SD大鼠,将其置于75%酒精中,浸泡并消毒15 min。然后将消毒后的大鼠放置于超净工作台上,用动物解剖器械分离大鼠的股骨和胫骨,分离完成后,用含1%肝素的无菌PBS液冲洗骨髓腔,直到冲洗液变无色透明为止,收集好冲洗液,并用离心机进行高速离心,离心后收集试管底部的细胞,选择使用Ficoll密度梯度离心法进行大鼠骨髓源性单核细胞的分离;分离后,将其接种于6孔板中,3天后进行首次换液,以后每隔3-4天换液,连续使用倒置显微镜观察细胞的形态变化并且使用激光共聚焦显微镜观察鉴定经Di I-ac LDL和FITC-UEA-1双荧光染色的EPCs;用流式细胞仪检测经过不同含糖浓度(5.5、15、30、60 mmol/L)处理后的EPCs凋亡率,挑出最佳浓度;使用高糖(30 mmol/L)和氧化应激拮抗剂Tempol、TNFR1受体拮抗MAB430共同作用,流式细胞仪检测细胞凋亡率;使用分子探针(DCFH-DA)检测不同糖浓度处理后EPCs的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)含量变化;使用Western blotting检测不同糖浓度和TNFR1受体拮抗MAB430处理EPCs后,其细胞表面TNFR1受体以及由其介导的细胞内信号通路相关蛋白(TRADD、TRAF2、RIP、NF-k Bp65、Caspase3)表达的情况。结果:在使用M199培养基培养3天后,EPCs大部分贴壁,呈圆形,逐渐增大伸展,培养至7天后,细胞生长迅速,镜下可见其呈集落样生长,培养至14天后,观察可发现细胞出现“鹅卵石”样形态分布。通过激光共聚焦显微镜观察细胞可见经过Di I-ac-LDL处理后阳性的EPCs为红色荧光,结合了FITC-UEA-1后的EPCs为绿色荧光,双染法阳性的细胞为正在分化的EPCs,表明所培养的细胞为EPCs。在高糖刺激EPCs的早期(24-48h),高糖组与对照组之间比较,没有明显的凋亡增加,而随着高糖刺激时间的延长,即高糖刺激的晚期(72-96h),可以发现高糖刺激组与正常对照组比较,凋亡细胞数目增加,高糖组(15mmol/L,30mmol/L,60mmol/L)与对照组进行组内比较,具有统计学意义(P<0.01);在同一时间点,将30mmol/L,60mmol/L的高糖组分别与15mmol/L高糖组相比,早期没有发现明显凋亡,而在刺激的晚期,仅发现60mmol/L的高糖组与15mmol/L的高糖组比较,细胞凋亡增加,具有统计学意义(P<0.01),在分别使用抗氧化剂Tempol、TNFR1受体拮抗剂MAB430处理EPCs24h、72h后,在与高糖组(30mmol/L)分别在24h,72h比较后,发现早期凋亡没有明显变化,而在晚期(72h)后,发现凋亡有明显下降,且数值具有显著统计学意义(P<0.01),同时在实验的早期,高糖组与对照组比较,ROS的值没有明显的增加,而随着刺激时间的延长,刺激的晚期(72h),发现高糖组ROS增加明显,与对照组比较,具有显著统计学意义(P<0.01),在刺激的早期和晚期,分别用Tempol、MAB430(TNFR1受体拮抗剂)处理后,发现与高糖组比较,早期ROS值没有明显的降低,而晚期ROS值有明显的降低,并且与高糖组比较,差异具有显著统计学意义(P<0.01),高糖(30mmol/l)刺激早期24h,TNFR1蛋白及其凋亡信号通路相关蛋白(TRAF2、TRADD、RIP、Caspase3)表达没有上调,而在刺激的72h后,相关蛋白表达明显上调,同时将上述蛋白表达量在72h与24h进行比较,差异具有显著统计学意义(P<0.01),氧化应激拮抗剂Tempol、TNFR1受体拮抗剂MAB430在72h能够降低上述TNF凋亡信号通路相关蛋白的表达,蛋白表达量有统计学意义(P<0.01),而随着高糖(30mmol/l)的刺激,NF-κBp65蛋白相对表达量是逐渐降低的,其蛋白表达量在72h与24h进行比较,差异具有显著统计学意义(P<0.01),在用Tempol、MAB430处理后,无论是早期还是晚期,与高糖组(30mmol/l)相比,其蛋白表达量是升高的,且差异具有显著统计学意义(P<0.01)。结论:1.高糖通过诱发内皮祖细胞氧化应激反应促进其凋亡,凋亡主要发生在刺激的后期,且具有浓度和时间的依赖性。2.高糖通过诱发内皮祖细胞氧化应激激活其TNFR1受体及其衔接蛋白TRADD,进而可能通过激活NF-κB p65转录因子,从而使得与凋亡直接相关的Caspase3蛋白表达增强,导致内皮祖细胞发生凋亡。