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纳豆作为一种传统食物,在日本被食用已有上千年的历史。纳豆激酶(Nattokinase,简称NK)是在纳豆发酵过程中由纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilisnatto)产生的一种碱性丝氨酸蛋白酶。研究表明,NK具有很强的溶解血栓能力,具有安全性好,作用迅速,可口服,易被人体吸收,药效持续时间长,易获取等优点。因此,NK作为一种新型的溶解血栓药物具有很大的研发前景。本研究通过PCR技术分别扩增包括枯草芽孢杆菌LNUB236的纳豆激酶成熟肽、前导肽与成熟肽、全长的纳豆激酶酶原基因,构建pET-26b原核表达载体和pGAPZαA真核表达载体,转化到大肠杆菌BL21菌株和毕氏酵母X-33菌株中诱导表达,并运用SDS-PAGE技术分析表达结果。利用纤维蛋白平板法对表达产物进行纤溶活性大小的测定。通过FoldX软件应用生物信息学方法对纳豆激酶热稳定性相关氨基酸进行分析预测,并利用重叠延伸PCR方法对预测的103-Gln、226-His和232-Ala三个氨基酸位点进行定点突变。通过构建分别包含纳豆激酶成熟肽、前导肽与成熟肽和全长基因三种原核表达载体,经IPTG诱导成功表达蛋白。SDS-PAGE电泳图结果显示在38kD大小左右出现特异蛋白条带。通过纤维平板法检测表达蛋白活性,结果只含有前导肽与成熟肽的重组载体以可溶蛋白形式表达并且具有纤溶活性。构建含有纳豆激酶前导肽与成熟肽真核表达载体,真核表达蛋白检测结果显示没有纤溶活性。对生物信息学预测纳豆激酶103位、226位和232三个位点进行突变后,酶活检测结果显示只有226位突变后具有酶活,但是酶活相对突变前活性降低。热稳定性检测结果显示,突变后纳豆激酶随着温度的提高酶活下降比未突变纳豆激酶平缓,不同温度处理纳豆激酶后,计算酶活损失率,结果显示突变后纳豆激酶温度从35℃升到60℃酶活损失率为56.82%,而突变前纳豆激酶酶活损失率为88.65%,纳豆激酶最高耐热温度结果表明突变后的纳豆激酶在64℃完全失活,而突变前纳豆激酶完全失活温度为62℃,结果表明突变后纳豆激酶热稳定性得到提高。