基于中医临床实践和经验的认识,以中医药方剂配伍理论和复杂性科学理论为指导,选择用于妇科血虚血瘀证痛经的桃红四物汤为研究对象,从类方、全方、药对、药味、成分多层面进行研究:基于方-证-病效应评价体系,选择与神经-内分泌-免疫-血液循环系统相关的指标,从整体、离体、细胞、分子四个药理水平评价生物效应;应用现代分析技术手段从全方、有效部位群、有效成分群三个化学层次揭示效应物质基础;结合药代动力学,体内代谢产物和病-证大鼠模型中代谢组学研究,进一步阐释作用机理;应用计算机统计分析方法研究组方配伍规律。本论文为探讨四物汤类方用于妇科血瘀证痛经的方-证-病相关性及类方间的共有规律性与各异性提供科学依据,为四物汤类方临床合理用药提供科学指导,也为方剂研究提供科学合理的研究思路、方法和技术平台。本论文共分为五章,各章节的主要内容及研究结果如下:一、文献研究与研究思路及设计方案该部分归纳整理了方剂研究的若干模式,总结本课题组类方研究的思路、方法与实践。对桃红四物汤相关文献进行整理,系统综述了用于妇科血瘀证原发性痛经桃红四物汤的临床应用、药理作用、物质基础及代谢特征的研究进展。在此基础上,理出研究思路,设计可行的实验方案和技术路线,为本论文的研究工作提供方向性指引与技术方法的参考。二、桃红四物汤的效应评价与物质基础研究(一)桃红四物汤供试样品的分离制备采用水煎煮的方法进行提取,应用现代分离技术大孔吸附树脂法对其不同化合物类型进行一定程度的分离纯化富集,获得桃红四物汤1-15个供试样品(THSW-1～THSW-15)。(二)桃红四物汤对病-证相关模型的效应评价1.桃红四物汤对血虚血瘀证大鼠模型的影响采用乙酰苯肼和环磷酰胺联用的方法,成功复制血虚血瘀证大鼠动物模型。结果表明此造模方法简单稳定且持续时间长,高、低剂量的桃红四物汤对血虚血瘀证大鼠动物模型均有不同程度的改善作用。2.桃红四物汤及各分离部位对小鼠原发性痛经模型的影响采用缩宫素诱导雌激素化小鼠扭体反应的原发性痛经模型,评价THSW-1～THSW-15供试样品对其影响。结果表明桃红四物汤挥发油部位、水提液部位、醇沉沉淀部位、醇沉上清液部位及30%～50%醇洗脱部位对缩宫素诱导雌激素化小鼠扭体反应有显著的抑制作用,其作用机理与降低子宫组织中Ca2+含量和提高NO水平有关。3.桃红四物汤及各分离部位对小鼠镇痛实验的影响采用热板致小鼠疼痛模型及冰醋酸致小鼠扭体反应疼痛模型,评价THSW-1～THSW-15供试样品对其影响。结果表明桃红四物汤水提液部位、醇沉沉淀部位、醇沉上清液部位及30%～40%醇洗脱部位具有显著的提高热板痛域值和抑制小鼠醋酸扭体反应的活性。4.桃红四物汤及各分离部位对小鼠离体子宫收缩模型的影响采用缩宫素诱导离体子宫收缩模型,评价THSW-1～THSW-15供试样品对其影响。结果表明桃红四物汤挥发油部位、水提液部位、醇沉上清液部位及30%醇洗脱部位具有显著抑制离体子宫收缩频率、幅度和肌张力的作用。(三)桃红四物汤对神经-内分泌-免疫-血液循环系统相关指标的影响1.桃红四物汤对大鼠脑组织、血清中神经递质的影响采用原发性痛经模型及急性血瘀模型,用酶联免疫法检测脑组织及血清中五羟色胺(5-HT)、β-内啡肽(β-EP)和去甲肾上腺素(NA)的含量。结果表明桃红四物汤对中枢和外周组织中5-HT、β-EP和NA的含量具有不同的调节作用。2.桃红四物汤拟雌激素样作用实验研究采用子宫增重实验方法,用放免法检测血清中雌激素水平,研究桃红四物汤拟雌激素样作用。结果表明在机体内雌激素浓度较低时,桃红四物汤具有一定的雌激素样作用;而在机体内雌激素浓度较高时,其又可与雌激素竞争结合雌激素受体,在一定程度上拮抗雌激素诱导的子宫增重效应。3.桃红四物汤及各分离部位对LPS刺激大鼠腹腔巨噬细胞释放NO的影响采用Griess法,间接测定THSW-1～THSW-15供试样品对脂多糖(LPS)刺激巨噬细胞释放NO的含量影响。结果表明20%～40%醇洗脱部位抑制率小于30%;50%～80%醇洗脱部位及水不溶部位抑制率大于30%而小于50%;95%醇洗脱部位抑制率大于60%。4.桃红四物汤及各分离部位对脾淋巴细胞增殖的影响采用MTT法,测定THSW-1～THSW-15供试样品对脾淋巴细胞增殖的影响。结果表明桃红四物汤水提液部位、醇沉沉淀部位、醇沉上清液部位、水不溶部位及0～40%醇洗脱部位不同剂量呈现显著的促进脾淋巴细胞增殖作用,具有免疫促进作用;50%～80%醇洗脱部位高剂量呈现显著的抑制脾淋巴细胞增殖作用,具有免疫抑制作用。5.桃红四物汤及各分离部位对凝血酶活性的影响建立一种凝血酶抑制剂筛选的便捷方法,测定THSW-1～THSW-15供试样品对凝血酶活性的影响。结果表明桃红四物汤醇沉上清液部位、水不溶部位及40%～70%醇洗脱部位具有显著的抑制凝血酶活性的作用(IC50<0.5 mg·ml-1)。6.桃红四物汤及各分离部位对体外ADP诱导血小板聚集的影响采用ADP诱导体外血小板聚集的实验方法,测定THSW-1～THSW-15供试样品对其影响。结果表明桃红四物汤挥发油部位、水提液部位、醇沉沉淀部位、醇沉上清液部位及20%～30%醇洗脱部位有显著的抑制ADP诱导的血小板聚集的作用。7.桃红四物汤及各分离部位抗氧化效应研究采用五种体外抗氧化实验方法,测定THSW-1～THSW-15供试样品体外清除自由基效应。结果表明桃红四物汤水提液部位、醇沉上清液部位及10%～30%醇洗脱部位呈现出显著的抗氧化效应。(四)桃红四物汤方药物质基础研究1.桃红四物汤水提液中化学成分的UHPLC-DAD-TOF-MS分析采用UHPLC-DAD-TOF-MS分析方法,对桃红四物汤水提液中的化学成分进行定性分析。结果共鉴定了 32个化学成分。2.桃红四物汤各分离部位中化学成分的UHPLC-DAD-TOF-MS分析采用UHPLC-DAD-TOF-MS分析方法,对THSW-2～THSW-14供试样品的化学成分进行定性分析。结果显示芳香酸类成分主要分布在醇沉上清液部位、0～80%醇洗脱部位,苷类成分主要分布在醇沉上清液部位、10%～40%醇洗脱部位,苯酞类成分主要分布在醇沉上清液部位、30%～40%醇洗脱部位。3.桃红四物汤水提液中化学成分的HPLC-DAD定量分析采用HPLC-DAD分析方法,对桃红四物汤水提液的化学成分进行定量分析。结果定量分析了没食子酸、苦杏仁苷、绿原酸、咖啡酸、羟基红花黄色素A、芍药苷、香豆酸、阿魏酸、苯甲酸、洋川芎内酯和洋川芎内酯H11种化学成分。4.桃红四物汤效应部位中主要成分的HPLC-DAD定量分析采用HPLC-DAD分析方法,对20%～50%醇洗脱部位的化学成分进行定量分析。结果在20%醇洗脱部位,定量分析了苦杏仁苷、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酸、香豆酸和阿魏酸;在30%～50%醇洗脱部位,定量分析了对羟基苯甲酸,芍药内酯苷,芍药苷,香豆酸,苯甲酸,阿魏酸,洋川芎内酯Ⅰ和洋川芎内酯H。三、桃红四物汤的体内过程及代谢机理研究(一)桃红四物汤在痛经模型大鼠体内的药代动力学研究采用DAS 2.0药动学软件进行拟合求解药动学参数,比较桃红四物汤水提液部位和醇沉上清液部位在正常和痛经模型大鼠体内的药代动力学特征。结果表明在痛经模型中,子宫组织剧烈收缩,导致机体对化学成分的吸收发生了变化。(二)桃红四物汤在痛经模型大鼠体内代谢产物的研究采用UHPLC-Q-TOF-MS分析方法,MetaboLynx软件处理分析。结果给药后在痛经模型大鼠尿液中初步鉴定了 22个代谢产物,粪便中初步鉴定了 4个代谢产物,胆汁中初步鉴定了 18个代谢产物。(三)桃红四物汤对血虚血瘀证模型大鼠代谢组学的影响采用UHPLC-Q-TOF-MS分析方法,MarkerLynx软件处理分析桃红四物汤水提液对血虚血瘀证模型大鼠尿液的代谢组学变化规律的影响。造模后共鉴定出11个重要生物标记物,并且找出7个生物标记物在造模前后有明显变化,给药后恢复到正常水平。(四)桃红四物汤对痛经模型大鼠代谢组学的影响采用UHPLC-Q-TOF-MS分析方法,通过MarkerLynx软件处理分析桃红四物汤水提液对痛经模型大鼠尿液的代谢组学变化规律的影响。造模给药后共鉴定了7个生物标记物,构建分析代谢通路,其机制可能与干预性激素和调控氨基酸通路有关。四、桃红四物汤组方配伍及其关联规律研究(一)桃红四物汤的组方结构和特点采用聚类分析和关联规则两种方法,分析桃红四物汤的组方结构和特点,发现有意义的药物组合。结果表明在中医古方方剂数据库搜得治疗痛经的258首方剂中,当归、川芎、熟地、白芍用药频率均达到70次以上,其中当归达到169次;配伍的桃仁、红花用药频率分别达到50次和38次;当归-红花配伍用药频率高达到39次,相对频率为15%,且从组方药味性味归经聚类分析结果可以看出当归-红花性味归经可归为一类,当归-红花是有意义的药物组合。(二)基于聚类分析的桃红四物汤生物效应与物质基础关联规律研究采用聚类分析方法,基于桃红四物汤及各分离部位的活性评价及成分分析结果,探讨桃红四物汤生物效应与物质基础的关联性。结果表明桃红四物汤的效应部位集中在大孔树脂50%醇洗脱之前,主要是芳香酸、单萜苷和苯酞类化合物;相邻部位在效应的表达上相似度较高,表明相邻梯度洗脱部位的化学物质存在一定的交叉。(三)桃红四物汤中桃仁-红花药对的作用特点及对整方的贡献1.桃红四物汤中桃仁-红花药对对整方的贡献采用血虚模型、急性血瘀模型和痛经模型,比较研究基本方四物汤、衍化方桃红四物汤以及配伍的桃仁-红花药对的生物效应。结果表明桃红四物汤保留了基本方补血的功效,且有增强的趋势,调经止痛功效略有增强,其改善血液流变学作用与配伍桃仁-红花药对后有较强的活血作用有关。2.桃红四物汤中桃仁-红花药对的作用特点采用UHPLC-Q-TOF-MS分析方法,通过MarkerLynx软件处理分析桃仁-红花药对共煎液中复杂的化学成分。结果表明桃仁-红花药对共煎液中苦杏仁和羟基红花黄色素A的含量明显高于有桃仁、红花单煎合并液。采用急性血瘀模型,比较桃仁-红花药对中主要成分羟基红花黄色素A和苦杏仁苷的活血化瘀作用。结果表明羟基红花黄色素A和苦杏仁苷是桃仁配伍红花活血化瘀作用的物质基础,且两种成分之间存在协同作用。(四)桃红四物汤中当归-红花药物组合的作用特点及配伍协同增效1.桃红四物汤中当归-红花药物组合配伍协同增效采用血虚模型和急性血瘀模型,比较当归配伍红花及单味药当归和红花的生物效应。结果表明当归配伍红花后,显示了一定的配伍协同增效。可能是两者配伍有利于有效成分的溶出,也可能是两者配伍后改变了主要效应成分群在体内动力学过程。2.桃红四物汤中当归-红花药物组合的作用特点采用UHPLC-Q-TOF-MS,HPLC-DAD分析方法,比较当归配伍红花中配伍前后化学成分的变化。结果表明当归红花配伍后芳香酸类化合物阿魏酸、绿原酸、香豆酸和黄酮类化合物羟基红花黄色素A含量增加;当归配伍红花较相同生药量下的单味药材凝血时间延长,DPPH的清除率增加。五、桃红四物汤与四物汤类方的关联分析(一)桃红四物汤与基本方四物汤的关联研究采用血虚模型、急性血瘀模型和痛经模型,比较研究基本方四物汤、衍化方桃红四物的生物效应。结果表明桃红四物汤保留了基本方四物汤补血的功效,且有增强的趋势,调经止痛功效略有增强。(二)四物汤类方功效物质基础对相关靶点及蛋白的研究1.四物汤类方中黄酮类化合物抗凝血酶作用研究采用凝血酶抑制剂筛选的便捷方法,并与分子对接虚拟筛选方法相结合,从四物汤类方的成分中筛选凝血酶抑制剂。结果表明四物汤类方中黄酮类成分具有较强的抗凝血酶作用,且具有一定的构效关系。2.四物汤类方中相关化合物拟雌激素样作用研究采用MCF-7乳腺癌细胞模型,研究四物汤类方中常见结构类型的38种化合物的拟雌激素样作用,结果表明其中22个化合物拟雌激素样作用较强,并与雌激素受体进行分子对接,准确率达到77.27%,此分子对接方法更适用于黄酮类和芳香酸类化合物的构型,不适用于生物碱类化合的构型。3.四物汤类方中芳香酸类化合物与人血清白蛋白相互作用研究采用荧光光谱法和分子对接虚拟筛选方法相结合,研究四物汤类方中10种芳香酸成分与人血清白蛋白(HSA)的相互作用规律。结果发现苯丙烯酸系列芳香酸与HSA的结合作用要明显强于苯甲酸系列芳香酸。