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阿尔茨海默病(AlzheimersDisease,AD)的主要症状是认知功能障碍以及学习、记忆能力的下降,其主要的病理学特征是脑内特别是在与学习、记忆功能密切相关的大脑皮层和海马等脑区沉积有高密度的老年斑。老年斑的主要成分是淀粉样β蛋白(Amyloidβ-protein,Aβ)。大量实验证实,Aβ具有广泛的神经毒性作用。AD病因的"Aβ学说”正是据此而提出的,AD患者出现的记忆功能下降很可能也正是Aβ发挥神经毒性作用的结果。
长时程增强(long-term potentiation,LTP)是由强直刺激作用于兴奋性突触传递通路诱发的一种突触传递效率长时间增强的现象,被公认为是一个很好的研究学习和记忆机制的细胞和电生理模型。近年来,包括我们在内的许多研究人员已就Aβ及其片段对海马LTP的抑制作用做了广泛报道。然而,Aβ及其片段对海马LTP的抑制作用机制还不完全清楚。研究表明,Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMK Ⅱ)是海马内含量最丰富的一种蛋白激酶。CaMK Ⅱ a亚单位基因突变或使用CaSK Ⅱ抑制剂后,小鼠空间学习能力将受到损伤,海马脑片上LTP的诱导也受到抑制。可见,CaMK Ⅱ的激活对基因表达、神经元可塑性、乃至学习记忆都起着至关重要的作用。长时程压抑(Long-term depression,LTD)是由低频刺激作用于兴奋性突触传递通路诱发的一种突触传递效率长时间减弱的现象,也被认为与大脑某些形式的学习过程有关,对清除旧记忆痕迹有着重要的作用。有证据表明CaMKⅡ也参与了LTD的诱导。
然而,采用电生理学方法诱导海马LTP/LTD的同时,是否一定存在有伴随LTP/LTD发生而出现的蛋白激酶组织化学即CaMKⅡ表达的变化还不清楚,特别是Aβ对LTP发生的抑制中是否伴随有CaMK Ⅱ的变化尚未见明确报道。因此,本研究在采用电生理手段记录大鼠海马CA1区场兴奋性突触后电位(fEPSP)的基础上,结合免疫组织化学技术同步测定海马脑片CaMK Ⅱ活性改变,探讨了LTP/LTD诱导与CaMK Ⅱ磷酸化水平的关系,以及CaMK Ⅱ在Aβ引起的在体海马LTP伤害中的作用,旨在为保护神经元和突触可塑性免受Aβ的伤害提供实验依据。结果显示：
(1)在稳定记录大鼠海马CA1区场电位30 min的基础上,给予高频刺激(HFS)后,fEPSP的幅度即刻增加到(204.38±10.22)％,30分钟后仍然保持较高水平(162.37±5.5)％,这表明了在体海马LTP的成功诱导。同时,应用免疫组化技术,比较测试刺激组(n=6)和高频刺激对照组(n=6)海马脑片CA1区CaMK Ⅱ磷酸化水平的结果显示：测试刺激组免疫反应阳性产物染色较淡,平均灰度值为165.01±9.43;高频刺激对照组染色较深,平均灰度值为132.53±8.19,磷酸化水平显著强于测试刺激组(P<0.01)。
(2)脑室注射Aβ25-35(25nmol,5μL,n=6)预处理15 min后,HFS引起的LTP明显受到抑制。fEPSP幅度在HFS后1分钟和30分钟时,分别为(171.71±6.74)％和(132.74±3.86)％,同高频刺激对照组相比,有显著差异(P<0.05)。增加Aβ25-35预处理时间到1h(n=6)后,HFS引起的LTP进一步受到抑制。fEPSP的平均幅度在高频刺激后1分钟和30分钟时,分别为(128.09±5.13)％和(102.54±5.17)％,与高频刺激对照组、15min预处理组相比,均有显著差异(P<0.05)。同时,海马CaMK Ⅱ磷酸化水平测定结果显示：高频刺激前15 min脑室注射Aβ25-35组的蛋白表达灰度值为152.27±7.68,与单独高频刺激的对照组(132.53±8.19)相比灰度值明显增大,表明CaMK Ⅱ磷酸化水平明显降低(P<0.05)：高频刺激前1h Aβ25-35预处理后,免疫反应阳性产物表达灰度值为163.93±7.14,与15min预处理组(152.27±7.68)相比进一步增加(P<0.05),表明CaMK Ⅱ磷酸化水平进一步受到压抑。
(3)低频刺激(LFS)成功诱导了LTD。LFS后1分钟、30分钟fEPSP幅度分别为(65.94±5.38)％和(85.41±2.39)％；LFS30分钟后进行免疫组化测定,CaMK Ⅱ免疫反应阳性产物平均灰度值为149.63±10.72,显著小于测试刺激组(P<0.05),表明磷酸化水平明显增强。
(4)HFS引起的LTP可以被LFS有效地逆转。HFS之后30分钟时的fEPSP立即由(158.33±6.80)％降低到LFS之后的(102.17±6.27)％(n=6)。LFS之后30分钟进行免疫组化测定显示,磷酸化的CaMK Ⅱ蛋白表达平均灰度值为138.52±9.84,与高频刺激对照组无显著差异(P>0.05)。
以上结果表明：(1)HFS、LFS海马CA1区LTP和LTD的同时,CaMKⅡ的磷酸化水平发生了不同程度的上调,其中在LTP诱导时较强,提示LTP和LTD诱导与CaMK Ⅱ磷酸化程度有密切关系；(2)Aβ25-35预处理不影响基础的突触传递,但可时间依赖性压抑海马LTP的诱导和降低海马CaMK Ⅱ的磷酸化水平,揭示了CaMK Ⅱ的下调可能是Aβ压抑海马LTP的一个重要机制；(3)LFS虽然可以逆转已经建立的LTP,但CaMK Ⅱ的磷酸化水平并没有随之发生明显的再调定。本实验用电生理方法结合免疫组化手段确认了CaMK Ⅱ参与海马LTP/LTD的诱导,并证实了CaMK Ⅱ磷酸化作用的下调可能参与了Aβ对在体海马LTP的伤害。由此我们推测,增强CaMK Ⅱ磷酸化有可能保护海马LTP免受Aβ伤害,并有可能促进AD病人学习记忆能力的恢复；同时,CaMK Ⅱ磷酸化的增强也有助于LTD的诱导,这可能与清除旧的记忆痕迹、使新的学习过程变得更加容易有关。