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细胞凋亡是目前的研究热点,二十世纪九十年代以来,与细胞凋亡相关的因子以及细胞凋亡的信号通路已逐渐清晰,特别是作为模式生物的线虫、果蝇与哺乳动物细胞等,然而杆状病毒诱导昆虫细胞凋亡的机制还十分模糊。我们以前的研究表明芹菜夜蛾核型多角体病毒(Anagrapha(Syngrapha)falifera multiple nuclearpolyhedrosis virus,AfMNPV)能诱导鳞翅目斜纹夜蛾(Spodoptera litura)SL-1细胞凋亡,并发现凋亡过程中线粒体膜电位降低,用Western检测到了线粒体蛋白细胞色素C从线粒体释放至细胞质基质中,其凋亡路径可能类似于与哺乳动物细胞凋亡的线粒体通路。为了进一步阐明AfMNPV诱导SL-1细胞凋亡的凋亡机制,本文拟探讨AfMNPV诱导SL-1细胞凋亡过程中线粒体结构变化以及凋亡相关蛋白的定位:
1.AfMNPV诱导SL-1细胞凋亡过程中线粒体的超微结构变化
对AfMNPV诱导凋亡的SL-1细胞线粒体进行超微结构观察发现:AfMNPV接种4小时可见SL-1细胞线粒体数量明显增多,线粒体嵴发生破裂;8小时后线粒体肿胀、变圆,线粒体嵴减少且空泡化,其他细胞器、细胞核、细胞质也发生明显的变化;16小时后线粒体固缩,电子密度增大,体积减小数倍。
2.凋亡相关蛋白的定位
细胞色素C与Bax蛋白是哺乳动物细胞凋亡线粒体途径中的凋亡相关蛋白质,正常细胞中Bax蛋白定位于细胞质基质,细胞色素C定位于线粒体膜。受到凋亡信号的刺激后,细胞色素C与Bax蛋白分别发生定位变化:Bax蛋白从细胞质基质转位插入线粒体膜,引起线粒体膜通透性的改变,从而导致细胞色素C从线粒体释放至细胞质基质中。
2.1细胞色素C的定位
AfMNPV处理SL-1细胞,于28℃培养箱分别培养4h、8h后用MitoTracker RedCMXRos标记线粒体,随后对细胞色素C进行标记,共聚焦显微镜照相,观察细胞色素C的定位情况。研究表明对照(正常SL-1细胞)中线粒体与细胞色素C共定位,病毒感染4h后,细胞色素C呈弥散状态,与线粒体不能共定位,说明从线粒体释放。
2.1 Bax样蛋白的定位
AfMNPV处理SL-1细胞,于28℃培养箱分别培养3h、6h后用线粒体染料标记线粒体,随后对Bax蛋白进行标记,共聚焦显微镜照相,观察Bax样蛋白的定位。研究表明,在正常细胞中,Bax样蛋白弥散分布在细胞质基质中,而AfMNPV处理SL-1细胞3h后Bax则与线粒体共定位,说明了在细胞凋亡过程中Bax蛋白从细胞质基质转位至线粒体。