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本研究以研究水稻对逆境的适应机理、分离水稻的耐逆基因、获得用于水稻抗逆遗传改良的基因为目的,采用Affymetrix水稻表达芯片与荧光定量PCR(qRT-PCR)分析了超级杂交稻亲本培矮64S全基因组表达模式,发现了众多逆境相关基因,从中筛选出一个耐逆候选基因Osgsr7(Oryza sativ L.multiplestress responsive gene7)。为了研究该基因在耐逆反应中的作用,构建了遗传转化载体、进行水稻的遗传转化,系统地进行了超量表达并对T3代转基因水稻进行抗冷、抗盐和ABA敏感性的鉴定。同时克隆了基因OsMsr7的启动子以及构建了该基因的融合表达载体,为抗逆转基因水稻的培育以及水稻的抗逆机理研究提供了有效的数据。研究获得的主要结果如下:
1、基因芯片数据分析表明,OsMsr7基因受低温、高温、干旱诱导；其平均上调幅度为9.9倍,最高上调幅度达31.3倍(高温),最低上调幅度为2.8倍。在原始载体pCAMBIA1300,pJIT163(含double CaMV35S启动子)的基础上,构建了OsMsr7过量表达载体,并转化水稻品种日本晴,获得了34株过量表达转基因植株。
2、荧光定量PCR(qRT-PCR)分析进一步验证了基因芯片的结果,二组数据基本吻合。
3、分离了水稻培矮64S四叶一心期的根和叶的总RNA,应用半定量RT-PCR方法分析表明,OsMsr7对干旱胁迫、盐胁迫、冷胁迫敏感,但是存在组织特异性表达。另外,对ABA影响不敏感。
4、根据GenBank已知相似基因序列设计特异寡核苷酸引物,通过RT-PCR扩增,获得了包含该基因完整ORF的cDNA克隆。该基因编码的氨基酸没有明显的结构域,氨基酸序列同源性比对分析,只在其他植物中只找到相似性较低的基因。对其可能的启动子序列分析,发现11类与逆境反应有关的顺式作用元件,推测该基因可能在逆境反应中起着重要的作用。
5、对OsMsr7的超量T3代纯系进行各种逆境处理:低温、高盐处理以及ABA敏感性分析。结果表明过量表达的转基因植株较对照水稻对低温、高盐及ABA更为敏感。
6、构建了GFP融合表达载体,结果显示该基因编码的蛋白定位在细胞核上。同时克隆了该基因的启动子。