【摘 要】
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目的:从已通过表型初步筛选的上百个突变品系里,挑选几个突变品系进一步鉴定调节Notch信号通路的基因,并研究其功能。方法:首先选择几个前期通过表型初筛的可能与Notch信号通路有关的突变品系,重复直接镶嵌克隆分析,并以果蝇中Notch通路的靶蛋白Cut和Wingless分别为一抗,通过免疫荧光染色确定所选突变品系与Notch信号通路的相关性,进行下一步的研究。之后以果蝇中Notch通路的组分NIC
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目的:从已通过表型初步筛选的上百个突变品系里,挑选几个突变品系进一步鉴定调节Notch信号通路的基因,并研究其功能。方法:首先选择几个前期通过表型初筛的可能与Notch信号通路有关的突变品系,重复直接镶嵌克隆分析,并以果蝇中Notch通路的靶蛋白Cut和Wingless分别为一抗,通过免疫荧光染色确定所选突变品系与Notch信号通路的相关性,进行下一步的研究。之后以果蝇中Notch通路的组分NICD和Delta分别为一抗,利用免疫荧光染色观察所选突变品系的NICD与Delta蛋白的表达情况等。接着利用MARCM克隆技术,对所选突变品系进行Notch通路上下游相互作用分析,探究该突变基因在Notch信号中的作用范围。提取果蝇突变品系的基因组DNA,进行反向PCR并对PCR产物进行测序。继而BLAST果蝇基因组找出Minos插入位点,确认Minos插入所影响的基因。此外,根据BLAST结果,对所筛突变品系进行互补实验,确定表型与所突变基因的一致性。最后本工作还将转座子从所选突变品系的基因组中跳除,验证筛选结果,排除遗传背景的影响。结果:（1）突变品系mf157经直接镶嵌克隆后,能引起果蝇成虫翅的严重缺刻和皱缩。（2）经镶嵌克隆分析和免疫荧光染色观察发现,mf157纯合突变克隆中,无Notch信号靶基因cut、wingless的表达。（3）mf157纯合突变克隆中的Notch、Delta在蛋白水平上表达无明显变化。（4）mf157作用于Notch信号发送细胞中,其作用范围与配体同级或是处于配体的上游。（5）测序表明mf157为Notch信号通路配体基因serrate新的有效突变体。此外,还鉴定出了另外两个致死突变品系mf553和mf167也为新的serrate有效突变体。（6）mf157、mf553和mf167三者之间的互补实验结果阐明serrate的突变造成了各自品系的致死。（7）转座子跳除实验证实突变品系mf157的表型由serrate的突变引起,不过mf157中存在着其它致死突变背景,但此背景不影响Notch信号的转导过程。结论:本工作得到了3个新的Notch信号通路的配体基因serrate的突变体,为更深入地研究serrate的功能与Notch信号通路的调控,提供了额外且有效的遗传突变资源以及新的思路。
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