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锌指蛋白(ZFP,Zinc Finger Proteins)是植物一大类重要的转录调控因子,参与调控一些重要的生理过程,如:形态建成、花粉发育、胁迫应答、胚胎发育等[1]。在前期研究中发现刚毛柽柳ThZFP基因可能是耐盐基因,因此本研究进一步对ThZFP基因的耐盐功能进行了研究,并对其耐盐调控机制进行了初步的分析。本研究从抗旱耐盐的木本植物刚毛柽柳转录组数据中鉴定了一条盐胁迫诱导表达的锌指蛋白(salt-induciblezincfinger)基因,命名为ThSZF3。ThSZF3基因全长1176bp,发现该基因编码391个氨基酸,分子量为97.26 kDa,理论等电点为5.00。亚细胞定位结果表明ThSZF3蛋白在细胞核中表达。构建了ThSZF3基因过表达载体pROKII-ThSZF3及RNAi载体pFGC5941-ThSZF3,将其与空pROKII载体瞬时转化到刚毛柽柳中,分别获得过表达(OE)、抑制表达(RNAi)及对照(CON)刚毛柽柳转基因植株并对转基因刚毛柽柳进行NaCl胁迫。分析比较了三种转基因刚毛柽柳中的DAB、NBT及Evans Blue染色以及POD、SOD、PRO、MDA、H2O2含量及相对电导率等生理指标以快速鉴定ThSZF3基因的功能。结果显示,在三种转基因植株中,过表达刚毛柽柳的POD、SOD活性和脯氨酸(PRO)含量最高,H2O2、MDA含量和相对电导率最低,细胞膜完整性最好,而ThSZF3抑制表达的植株POD、SOD活性和PRO含量最低,O2-、H2O2和MDA最高,相对电导率最高,细胞膜损伤最严重。结果表明ThSZF3能够提高柽柳细胞内抗氧化酶活性,促进活性氧清除,降低细胞膜损伤,从而使柽柳适应高盐环境。为了进一步验证刚毛柽柳中瞬时表达ThSZF3基因的结果,将ThSZF3基因过表达载体转入野生型拟南芥,筛选获得T3代纯合株系。对转基因及野生型拟南芥进行150mM NaCl胁迫,分析比较盐胁迫前后转基因和对照拟南芥的种子萌发率、根长、鲜重及长势等生长指标,结果显示盐胁迫后过表达株系的种子萌发率、根长和鲜重都明显高于对照,长势也优于对照,表明转基因转系的耐盐能力显著提高,过表达ThSZF3基因能提高转基因拟南芥的耐盐能力。进一步分析比较了盐胁迫前后转基因及野生型对照株系的 DAB、NBT、Evans blue 染色以及 POD、SOD、PRO、MDA、H2O2含量、相对电导率等生理指标,结果显示与瞬时转化刚毛柽柳结果一致,盐胁迫后转基因拟南芥株系的染色更浅,POD、SOD、PRO含量最高,MDA、H2O2含量和相对电导率值明显低于对照。表明ThSZF3基因能通过减少转基因植株细胞内的活性氧积累,保护细胞膜的完整性,从而提高转基因植物的耐盐能力。利用以转录因子为中心的酵母单杂交技术(TF-centered Y1H),鉴定ThSZF3识别和结合的顺式作用元件。结果表明ThSZF3能够特异性的识别4个DNA序列,包括一个未知的新元件 SBS(SZF Binding Site)和 3 个已知元件(Dof、CAAT-box、G-box)。通过酵母单杂交验证得出SBS元件核心序列为“CTGCC”。利用转录组测序鉴定ThSZF3过表达、抑制表达及对照柽柳之间的差异表达基因。ThSZF3过表达柽柳与对照之间上调表达的基因有22个;ThSZF3抑制表达柽柳与对照之间下调表达的基因140个。两组共有的基因有6个。经过序列比对发现“CTGCC”元件存在于其中4条基因启动子序列中,选择其中一个柽柳乙烯不敏感蛋白ThEIN2(Ethylene-insensitive protein 2)的启动子序列进行探究,酵母单杂交结果显示ThSZF3能够与ThEIN2包含SBS元件的启动子片段结合,推测可能为ThSZF3所调控的下游基因。