白血病是严重危害人类健康的疾病,且由于环境等恶化,白血病的发病呈上升趋势。越来越多的研究者都开始关注白血病的发生机制,试图通过探索白血病的发病机制找到白血病治疗的有效途径。最新的有关白血病的研究表明:γ分泌酶抑制剂可以通过调节Notch1信号通路抑制白血病细胞的增殖,有望成为白血病治疗的新途径。γ分泌酶是膜内切割蛋白酶家族(intramembrane- cleaving-proteases, I-Clips)的成员,该家族的酶都可以在脂质双分子层内部催化肽键水解。γ分泌酶广泛存在于体内的组织细胞中,可以切割多种I型跨膜蛋白,如γ-淀粉样多肽的前体蛋白(APP), Notch受体, CD44, E-钙黏蛋白等。生物化学及基因方面的证据表明:γ分泌酶由4个亚基组成,它们分别为PS1(presenilin), NCT(nicastrin), APH1(anterior-pharynx-defective-1), PEN2(presenilin enhancer-2,4个亚基按照1:1:1:1的比例组合,空间排列紧密有序。γ分泌酶四个亚基功能各异,PS1是催化亚基,有切割底物的功能,在生物体中,PS1首先以无活性的全蛋白形式分泌,再经生理性分子内部水解,裂解为由~20Kda的PS1-C端(PS1-CTF)和~30Kda的PS1-N端(PS1-NTF)构成的异源二聚体,有催化活性的PS1都是以异源二聚体的形式存在的,PS1发生突变是阿尔茨海默病(AD)发病的重要原因;APH1和PEN2是2个较小的亚基,APH1是γ分泌酶复合体组装过程中的支架,能够稳定有活性的PS1;NCT是γ分泌酶的重要亚基,发挥着底物受体的作用,即γ分泌酶的底物被PS切割之前,要先被NCT特异识别并结合,NCT广泛存在于人体和大鼠的所有细胞系,与γ分泌酶的组装和成熟密切相关,研究者证明:NCT的高表达可以通过提高γ分泌酶的活性进而促进对其底物Aγ的切割,因此是阿尔茨海默病治疗的潜在靶点。Notch基因广泛存在于多种物种中,其家族成员在进化上高度保守,介导的信号通路更是参与了胚胎发育、血细胞发育和肿瘤形成等多个病理生理过程。在白血病细胞的增殖分化决定中,Notch发挥着重要的作用。Notch是γ分泌酶的底物,迄今为止,在哺乳动物体内发现了4种基因,他们编码4种跨膜受体蛋白,分别为Notch1-4。目前对Notch1的了解较为深入,Notch1在体内依次经过ADAM金属蛋白酶、γ分泌酶切割后在细胞膜上释放活性胞内片段ICN1(Intracellular domain Notch1)入核,在核内,ICN1通与转录调节因子CSL结合,同时招募MAML,形成CSL-ICN1-MAML三元复合物,该复合物可作为转录活化因子,激活HES(hairy enhancer of split)、HRP(HES—related repressor protein)等Notchl靶基因的转录,进而对细胞增殖和分化起始的过程进行精确调控。NCT在此生理过程中发挥重要的作用,NCT突变可以导致在生长发育各个阶段的细胞命运决定缺陷。因此本实验最初旨在通过高表达NCT提高γ分泌酶对Notch1的切割,进而观察对白血病细胞增殖和分化的影响。因此在第一部分实验中,我们构建了pcDNA3.0-NCT重组质粒,在HL-60细胞中表达并且获得稳定高表达NCT的细胞株,通过绘制生长曲线和流式细胞仪检测细胞的生长和分化情况,检测结果与预期相反:NCT高表达抑制白血病细胞的增值,促进白血病细胞的分化。因此我们假设,γ分泌酶可以通过影响其他信号通路调节白血病细胞的生长和分化。LIF,白血病抑制因子,是一种多效性细胞因子,可作用于多种组织细胞发挥不同的生物学作用,比如刺激血小板生成,造血细胞增殖;促进神经原形成,肌肉卫星细胞的增殖,参与神经肌肉修复。这些生物学效应的发生依赖于LIF和细胞膜上LIF受体(LIFR)结合启动下游信号通路,靶细胞膜上的LIFRγ亚基(gp190),可与LIFRγ亚基(gp130)形成异源性二聚体,进而激活下游信号转导通路。人们已证明,生理状态下存在可溶性和完整性gp190两种形式。可溶性LIFR游离于胞外,无跨膜区和细胞内区,可以拮抗LIF发挥的正常生理效应。gp190是LIF的特异性受体,完整性gp190包括胞外区、跨膜区和胞内区,其胞内区含有三个功能域,由近膜端至远膜端依次为BOX1、BOX2和BOX3,以往的研究工作表明,在无LIF诱导的情况下,高表达LIFR亚基gp190也可以激活白血病细胞下游的信号转导通路。设计包含BOX3的小分子-190CT3,并在白血病细胞中高表达,通过检测JAK/STAT3以及P44/P42MAPK信号转导通路下游信号分子以及磷酸化水平,发现其确实具有LIF受体的信号启动效应从而抑制白血病细胞的生长。gp190是I型跨膜蛋白,γ分泌酶能够切割I型跨膜蛋白进而影响下游信号通路,因此我们大胆提出γ分泌酶能够切割gp190产生gp190-CTF的假设,本实验第二部分别通过抑制和提高γ分泌酶的活性来探索γ分泌酶和gp190的关系,我们首先通过γ分泌酶抑制剂干扰实现酶活性的下降,再通过NCT的过表达实现γ分泌酶对底物切割作用的提高,从正反两个方面验证我们的假设。目前对于NCT的研究重点主要集中在NCT与阿尔茨海默病的关系上,更多的研究者企图通过γ分泌酶抑制剂的应用来抑制γ分泌酶的活性,进而阻止Aγ的产生,起到对阿尔茨海默病的治疗作用,关于γ分泌酶和其他I型跨膜蛋白的关系则研究很少。本实验分两个部分创新的探讨了高表达NCT对白血病细胞增殖和分化的影响,对进一步研究γ分泌酶在造血系统中的作用奠定了基础,为白血病的治疗提供了新的可能性。第一部分、Nicastrin重组质粒的构建以及其在HL-60细胞中的表达及鉴定方法: (1)重组质粒pcDNA3.0-NCT的获得及鉴定:设计引物5 -CGGGGTACCAGAGGCAAGATGGCTACGGCAG-3, 5 -TTTGCGGCCGCCCC AGGGAGGTTCCAGTGACAA-3 ,以MSCcDNA为模板,PCR获得包含NCT蛋白编码区的目的片段,共2.174kb。PCT产物经KpnI、NotI酶切、T4连接酶连接、转化、挑选克隆后成功构建载体pcDNA3.0-NCT,且测序正确。(2)重组质粒pcDNA3.0-NCT转染HL-60 ,同时设置pcDNA3.0空质粒转染组、野生组HL-60作对照组。G418筛选转染pcDNA3.0-NCT及pcDNA3.0组HL-60细胞15d,挑选生长旺盛的克隆扩增,离心收集细胞,通过RT-PCR和蛋白印迹(Western blot)进行蛋白半定量检测,获得稳定高表达NCT的HL-60细胞株,保存以备后面实验使用。结果:(1)PCR产物电泳后与紫外灯下观察可见大小相符合的片段,约2.2kb;重组质粒依次经KpnI、NotI酶切后、电泳紫外灯下观察可见大小约5.2kb和2.2kb左右的片段,质粒测序结果与Genbank核酸序列数据库中NCT序列比对,匹配率100%,成功获得重组pcDNA3.0-NCT的真核表达质粒。(2)G418筛选后获得稳定转染pcDNA3.0-NCT的HL-60细胞株,RT-PCR、Western blot半定量检测NCT mRNA及蛋白表达,结果显示:和对照组细胞NCT表达水平相比,pcDNA3.0-NCT转染组NCT的表达量明显升高,我们获得稳定高表达NCT的细胞株,保存以备下一步实验。(3)绘制生长曲线,与对照组细胞相比,pcDNA3.0-NCT转染组细胞生长受到抑制。流式细胞仪显示pcDNA3.0-NCT转染组细胞表面CD15/CD11b表达最高。结论:(1)KpnI、NotI双酶切鉴定、测序均证明我们成功构建了重组质粒pcDNA3.0-NCT;(2)G418筛选生长旺盛的阳性克隆,经半定量RT-PCR检测、Western blot检测获得稳定高表达NCT的HL-60细胞株;(3)相比pcDNA3.0转染组以及野生组细胞,转染NCT的HL-60细胞增殖受到明显抑制,CD15及CD11b的表达量增高,细胞向成熟方向分化。第二部分、LIF受体α亚基gp190以及与γ-secretase关系的研究方法:(1)γ分泌酶抑制实验:将NCT高表达组、空质粒转染组、野生组细胞培养在12孔板中,每组细胞4孔,每孔细胞生长至1×10~7,加入γ分泌酶抑制剂,抑制剂浓度分别为:0nM(DMSO),25 nM,50 nM,和100 nM,抑制时间均为8小时,抑制剂浓度和时间通过预实验确定,8小时后,裂解细胞,western blot检测gp190全长(gp190-FL)及gp190-CTF,PS1-NTF、PS1全长(PS1-FL)、NCT的表达情况;(2)pcDNA3.0,wild type ,pcDNA3.0-NCT转染组细胞生长至1×10~7离心收集细胞,western blot检测gp190-FL,gp190-CTF,NCT的表达水平。(3)LIF刺激试验:pcDNA3.0-NCT组、pcDNA3.0组、野生组细胞生长至1×107后加,入浓度为60ng/ml的LIF,LIF刺激时间分别为12h、24h、48h之后,分别离心收集三组细胞,western blot检测gp190-FL,gp190-CTF,PS1-FL,PS1-NTF的表达;LIF刺激浓度通过预实验确定。(4)检测pcDNA3.0-NCT、pcDNA3.0、野生组HL-60细胞下游信号分子STAT3磷酸化水平,细胞生长至1×10~7,离心收集细胞,western blot检测三组细胞STAT3的磷酸化水平。(5)免疫共沉淀检测gp190和NCT的相互作用情况,LIFR抗体做沉淀,NCT抗体做western blot。结果:(1)γ分泌酶抑制剂干扰实验结果示:加入γ分泌酶抑制剂后,随着抑制剂浓度的逐渐增加,PS1-NTF表达逐渐减弱,PS1-FL蛋白的表达增高,这标注着γ分泌酶活性逐渐下降;gp190-CTF的表达逐渐减弱,NCT和gp190-FL的表达未见明显变化;(2)和pcDNA3.0转染组以及野生型HL-60相比,pcDNA3.0-NCT转染组细胞,PS1-NTF表达逐渐增加,PS1-FL蛋白表达减少,这标志着γ-secretase分泌酶活性升高;gp190-CTF表达逐渐增加,gp190-FL表达各组细胞间未见明显区别;结论:(1)γ分泌酶抑制实验,酶活性受到抑制后,gp190-CTF表达减弱,且gp190-CTF的表达量和γ分泌酶抑制剂浓度呈反比,随着γ分泌酶抑制剂浓度的逐渐增加,gp190-CTF表达逐渐减弱;(2)NCT高表达组HL-60细胞,western blot检测可见更多的gp190-CTF表达;(3)对每组细胞而言,随着LIF刺激时间的增加,gp190-CTF的表达逐渐增加。(4)STAT3磷酸化表达水平的检测示:STAT3的磷酸化水平为pcDNA3.0-NCT〉pcDNA3.0〉野生组HL-60。(5)加入gp190抗体免疫共沉淀检测可以检测到NCT的表达。综上所述,第二部分实验表明,γ-secretase可能有切割gp190,产生游离C末端的作用,且通过影响下游信号分子STAT3磷酸化水平-调节HL-60细胞的增殖和分化。小结本实验的两个部分围绕γ分泌酶和gp190相互关系以及对白血病细胞生长和分化的研究展开。通过构建及转染pcDNA3.0-NCT获得稳定高表达NCT的HL-60细胞,并观察到NCT高表达可以抑制白血病细胞的增殖、促进白血病细胞的分化。研究γ分泌酶和gp190关系的实验表明:随着γ分泌酶抑制剂浓度的增加,gp190-CTF表达逐渐减弱;NCT高表达导致gp190-CTF表达明显升高。pcDNA3.0,pcDNA3.0-NCT,野生组细胞均随着LIF刺激时间增长,gp190-CTF的表达逐渐增加,且NCT高表达可以促进细胞内信号分子STAT3的磷酸化水平;免疫共沉淀的结果揭示了gp190和NCT的相互作用。实验总结:生理状态下,γ-secretase可能切割gp190产生细胞内的游离功能域,参与信号传递过程,进而抑制白血病细胞的增值、促进白血病细胞分化。本实验创新的研究了γ分泌酶与LIFR亚基gp190的关系,为研究γ分泌酶在造血系统的关系奠定了基础,为白血病治疗寻找新的靶点提供了可能性。