论文部分内容阅读
目的: 从PKCε信号通路及AE3蛋白Ser67位点磷酸化程度改变的角度探讨SQS调控AE3蛋白反向交换Cl-/HCO3-活性，促进缺氧/复氧(H/R)损伤心肌细胞内Cl-外排的分子机制。 方法: 1.H9c2心肌样细胞经10μM SQS预处理24 h后建立缺氧/复氧(H/R)损伤模型，随后通过Western Blot法检测PKCε磷酸化水平，观察SQS预处理对PKCε活性的影响; 2.利用H9c2心肌样细胞，在抑制PKCε或感染AE3蛋白Ser67点突变(Ad-AE3-S67A)腺病毒表达载体的情况下给予10μM SQS预处理24 h后，建立H/R模型，通过免疫沉淀法检测AE3磷酸化水平，观察SQS预处理是否通过激活PKCε促使AE3蛋白的Ser67磷酸化; 3.为了进一步支持PKCε的激活及AE3蛋白的Ser67位点在SQS促AE3磷酸化的依赖性作用，我们利用AE3野生型(Ad-AE3)及Ser67点突变型(Ad-AE3-S67A)腺病毒表达载体感染H9c2心肌样细胞，随后经PKCε激活剂DCP-LA处理后，建立H/R模型，通过免疫沉淀法检测AE3磷酸化水平，直接观察PKCε信号通路的激活对AE3蛋白Ser67磷酸化的影响; 4.利用H9c2心肌样细胞，在抑制PKCε或感染Ad-AE3-S67A的情况下给予SQS预处理，建立H/R模型，通过检测以下变化，探讨PKCε依赖的AE3蛋白Ser67磷酸化与SQS调控AE3蛋白反向交换Cl-/HCO3-活性，促进H/R损伤心肌细胞内Cl-外排的关系:①免疫沉淀法检测AE3蛋白磷酸化水平;②流式细胞术检测细胞内Cl-浓度;③荧光分光光度检测AE3蛋白Cl-/HCO3-交换活性; 5.利用H9c2心肌样细胞，在抑制PKCε或感染Ad-AE3-S67A的情况下给予SQS预处理，随后建立H/R模型，通过检测以下变化，探讨PKCε依赖的AE3蛋白Ser67磷酸化与SQS抗H/R所诱发的Ca2+超载、ROS生成及心肌细胞损伤的关系:①免疫沉淀法检测AE3蛋白的表达及其磷酸化水平;②MTT比色法检测细胞存活率;③比色法检测细胞内LDH、CPK活性;④流式细胞术检测Ca2+浓度;⑤荧光显微镜检测细胞内活性氧(ROS)。 结果: 1.在H9c2细胞中，SQS预处理能够显著提高PKCε磷酸化水平，但不影响PKCε总蛋白的表达;然而，在SQS预处理前优先给予PKCε特异性抑制剂εV1-2处理，SQS上述作用被取消; 2.在H9c2细胞中，SQS预处理能够显著提高AE3蛋白的磷酸化水平;然而，在抑制PKCε或感染Ad-AE3-S67A的情况下给予10μM SQS预处理，SQS提高AE3蛋白磷酸化的作用均被抑制; 3.在感染Ad-AE3的H9c2细胞中，PKCε激活剂DCP-LA预处理能够显著提高AE3蛋白的磷酸化水平;然而，在感染Ad-AE3-S67A的H9c2细胞中，DCP-LA促进AE3蛋白磷酸化的作用被抑制; 4.在H9c2心肌样细胞中，SQS预处理在促进AE3蛋白磷酸化的同时能够增强AE3蛋白反向交换Cl-/HCO3-活性，促进H/R损伤心肌细胞内Cl-外排;然而，在抑制PKCε或感染Ad-AE3-S67A的情况下，SQS增强AE3蛋白反向交换Cl-/HCO3-活性，促进H/R损伤心肌细胞内Cl-外排的作用随着AE3蛋白Ser67磷酸化的抑制而逆转; 5.在H9c2心肌样细胞中，SQS预处理在促进AE3蛋白磷酸化的同时能够对抗H/R所诱发的Ca2+超载、ROS生成及心肌细胞损伤;然而，在抑制PKCε或感染Ad-AE3-S67A的情况下，SQS对抗H/R所诱发的Ca2+超载、ROS生成及心肌细胞损伤的作用随着AE3蛋白Ser67磷酸化的抑制而逆转。 结论: PKCε依赖的AE3蛋白Ser67磷酸化是SQS增强AE3蛋白反向交换Cl-/HCO3-活性，促进H/R损伤心肌细胞内Cl-外排，产生心肌保护的关键分子机制。