内酯酶是一种内酯水解酶,能够高效催化内酯类化合物酯键的水解,生成对应的羟基酸。其独特的催化特性使其广泛用于食品工业、医药化工等领域。已有报道内酯酶大部分属于金属β-内酰胺酶超家族,少数属于α/β水解折叠酶超家族,极少数属于磷酸三酯酶超家族。其中,α/β水解折叠酶超家族的成员一般是酯酶或脂肪酶,但是它们中的部分具有混杂的催化效率较低的内酯酶活性,因此不作为一般的酯酶而是内酯酶。然而,该家族的内酯酶由于其良好的稳定性以及非金属依赖性受到广泛关注。因此,深入研究α/β水解折叠酶超家族内酯酶的酶学性质并阐明结构功能关系从而进一步提高其催化效率具有重要研究价值。本论文以伊斯隆恩西斯芽孢杆菌酯酶Solibacillus isronensis esterase（SIEst）为研究对象,构建了SIEst的重组表达菌株并获得重组酶、开展酶学性质表征研究;结合理性分子设计、定点突变等手段进一步提高SIEst内酯酶活性,相关研究结果为指导该酶的进一步分子改造及应用提供科学指导。主要开展的研究内容和结果如下:（1）SIEst的生物信息学分析。以已报道的内酯酶MLH作为模板,从NCBI数据库中筛选获得来源于伊斯隆恩西斯芽孢杆菌基因组中的一个潜在的内酯酶基因,命名为SIEst。利用分子进化遗传学分析及多重序列比对对SIEst基因序列进行分析。结果表明,SIEst与乙酰酯酶家族的亲缘关系相近,可能属于乙酰酯酶家族的一个新的分支,推测SIEst具有混杂的催化活性,可催化包括短链酯类化合物的水解和部分内酯化合物的水解。SIEst编码蛋白中具有典型的保守五肽基序G-X-S-X-G,由Ser150/Asp242/His272组成该酶的催化三联体。在活性位点保守基序的上游存在保守的HGGG基序（氨基酸76-79）,该基序参与氢键相互作用以稳定氧阴离子洞并在催化中起关键作用。SIEst预测理论分子量为33.87 k Da,等电点为6.08,脂肪族系数和不稳定系数显示SIEst可能是一种热不稳定蛋白,在体外易发生降解。（2）SIEst的异源表达及酶学特性研究。采用全基因合成技术获得SIEst的基因,利用无缝克隆技术成功将SIEst基因克隆至表达载体p ET28a中。将p ET28a-SIEst重组质粒转入E.coli BL21（DE3）构建获得重组表达菌株。SDS-PAGE电泳检测发现,SIEst诱导时间显著影响SIEst的可溶性蛋白表达。通过对诱导时间进行优化,获得蛋白表达最佳诱导时间为12 h,温度为20℃。每1 L发酵液可获得2.33 mg的目的蛋白。以对硝基苯酚乙酸酯为底物对SIEst的酶学性质进行表征,结果显示:SIEst的最适反应温度为20℃,该酶在30℃条件下的t1/2为90 min,当温度大于30℃时酶活力会迅速衰减。SIEst的最适反应p H为8.0,在弱碱性的环境中较为稳定。SIEst对8种不同的内酯和5种不同酯类化合物的底物特异性实验结果表明,SIEst对非环型底物具有偏好性,比如乙酸辛酯(kcat/Km=4174.54),相反的,该酶对环状的内酯型底物催化能力较弱。其中,催化效率最高的是γ-十二内酯(kcat/Km=586.57)。（3）基于结构理性设计提高SIEst的内酯酶活性。同源建模构建了合理的SIEst蛋白质三维模型。结构比对分析结果表明:SIEst是典型的α/β水解折叠酶,整体由“盖子”结构与和催化结构域两部分组成。SIEst与常见的两个内酯酶MLH和Aid H结构的整体骨架十分相似,并且催化三联体在空间上也高度保守,但是活性口袋的形状截然不同,这可能是导致SIEst内酯酶活性较弱的原因。以内酯酶MLH和Aid H为参照,结合分子对接结果,预测与底物相互作用的位点并选取其作为分子改造位点,进行突变体设计。构建了六个突变体,分别是F82A、Y178A、W198A、W207A、F244A和K204L。酶促反应动力学测定实验结果表明,SIEst的6个突变体中有4个（W198A、W207A、F244A和K204L）提高了对ε-己内酯的水解催化效率。对于ε-己内酯,最佳变体是F244A,其kcat/Km比wt SIEst提高了48倍。由此可得,增加内酯酶活性口袋中的内酯环结合区域的空间或将是提高α/β-水解酶折叠酶中的内酯酶催化效率的有效途径。