猪SRPK1及SRPK3基因的克隆、表达及多态性研究

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精氨酸-丝氨酸蛋白激酶(SRPK)基因是SR蛋白特异磷酸化激酶基因家族成员之一。其中SRPK1被定位于一段控制脂肪性状的QTL区域,而SRPK3的过量和减少表达都会导致肌卫星细胞出现病变或导致生物个体死亡。因此,应用现代分子生物学技术研究猪SRPK1、SRPK3基因的分子遗传结构和作用模式,对研究猪肉质性状有十分重要的理论意义,并为分子标记辅助选择和转基因猪打下基础。本研究以大白猪为研究对象,克隆了大白猪SRPK1基因和SRPK3基因,对其结构和功能及分子进化进行了分析,并对1日龄和30日龄的大白猪和杜洛克猪的心、肝、脾、胃、肾、肺、大肠、小肠、脑、肌肉的表达情况进行了比较分析。检测了SRPK1和SRPK3基因部分外显子的多态性;构建了猪骨骼肌损伤模型,检测SRPK1、SRPK3在骨骼肌损伤修复过程中的表达情况,并通过该模型研究SRPK1、SRPK3、MyoD、FoxOI、MEF2A、MEF2B和MEF2D基因的相关性。主要研究结果如下:(1)利用RT-PCR和I-PCR技术克隆了SRPK1基因的mRNA序列2499bp其中包括1968bp完整的CDS区域和325bp的5’UTR序列,编码656个氨基酸;获得SRPK3基因的1708bp核苷酸片段涵盖SRPK3的全长CDS区域,共编码567氨基酸。(2)利用生物信息学方法分析SRPK1、SRPK3基因核酸序列及编码蛋白序列的结构特点发现各自都包括1个P Kc和1个ATP-binding结构域,猪SRPK1蛋白序列与人和黑猩猩的相似性较高。SRPK1的5’UTR含有多种转录结合位点:HSF1, HSF2, Ik-1, IK-2, SRY, SP1 MyoD, USF, E47, p300, CP2, RREB-1, E2F, AP-1。猪SRPK1及SRPK3蛋白序列与人和牛的相似性较高。(3)利用PCR-SSCP技术对大白猪、民猪、野家杂交猪的SRPK1基因的第8、10、11、16外显子和SRPK3的第6、9外显子进行了多态性检验。结果显示SRPK1所检测的外显子区域无多态性,SRPK3的第6外显子上有A629→G629,T653→T653的突变,氨基酸变化为Pro→His, Ile→Thr;第9外显子处的G1059→A1059,氨基酸无突变。(4)猪SRPK1和SRPK3基因表达都具有组织和品种间特异性,SRPK1主要在消化器官处表达而SRPK3基因主要在肌肉和心肌内表达。(5)SRPK1基因在骨骼肌损伤修复过程中出现升高和降低反复交替的现象,SRPK3的表达持续升高。(6)检测了包括MyoD、MEF2A在内的其他几个成肌因子的骨骼肌上修复过程中的表达情况,并分析了它们之间的相关性,结果显示仅SRPK1与SRPK3相关极显著(p<0.01),SRPK1与MEF2D相关显著(p<0.05),其他各组都不显著(p>0.05)。
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