阳离子抗菌肽G13分泌表达系统的构建

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为进一步深入研究阳离子抗菌肽G13的结构功能关系,摸索高效表达的方式,我们构建了原核分泌表达系统。质粒pET-22b(+)能将外源蛋白分泌到大肠杆菌细胞周质中,有利于分离纯化目的蛋白。在G13的基础之上用平末端连接的方式拼接相关融合蛋白基因,成功构建重组质粒pET-22b(+)-DPG13、pET-22b(+)-D3PG13、pET-22b(+)-C-DPG13、pET-22b(+)-C-D6PG13DP,利用信号肽的引导作用进行G13的分泌表达。结果只有pET-22b(+)-C-DPG13得到目的蛋白,虽然产量达不到要求,但证明了原核分泌表达系统表达G13的可行性,G13序列的改造、诱导表达条件的优化等需要进一步实验来完成。   为评估G13作为饲料添加剂的可行性,本实验构建了真核分泌表达系统。PCR搭桥获取以酵母密码子偏好性设计的G13序列,TA克隆测序。双酶切后连接整合型载体pPIC9,成功构建pPIC9-G13。线性化重组质粒,经过乙醇沉淀处理电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞,筛选His+Mut转化子,相应培养基诱导表达。抑菌实验未检测到生物活性,蛋白电泳也没有检测到目的蛋白。后续试验应着手验证mRNA是否转录翻译,明确G13无法表达的原因。同时本实验用PCR搭桥得到来源于鱼类的抗菌肽Pleurocidin以及人防御素hBD-3的基因,成功构建了重组质粒pPIC9-Ple、pPIC9-HBD-3,这两种抗菌肽在食品和医疗方面具有潜在的应用价值,转化子的保存为后续的表达研究打下了基础。   本实验还从巢湖分离得到一株微囊藻,命名为chaohu-1,序列已提交GenBank。我们利用分子生物学方法鉴定了其种属是铜绿微囊藻;通过HPLC检测了产毒特性,证实了此藻株产生MC-LR藻毒素;此外还建立了该藻株可行的冻存复苏体系。
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