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随着各种纳米材料不断实现工业扩大化生产以及纳米产品市场化,纳米材料对环境和健康的潜在影响已受到科学界和政府部门的广泛关注。纳米二氧化钛是目前应用较广的一种纳米材料,可引起体内氧胁迫及炎症反应,甚至诱发肺癌的产生。本论文以秀丽隐杆线虫为研究模型,着重研究二氧化钛纳米颗粒对线虫生殖细胞死亡和产卵率的影响;并在此基础上,利用细胞凋亡关键基因突变等线虫品系,探讨纳米二氧化钛颗粒暴露诱导线虫生殖细胞凋亡相关的信号转导途径。
1.纳米二氧化钛颗粒物理化学性质的表征。
本论文首先对5nm和40nm两种不同粒径的二氧化钛颗粒进行了物理化学性质的表征,包括表面积、粒度分布、zeta电位的测定以及透射电镜观察等。结果发现在纯水体系中纳米二氧化钛呈现不同程度的团聚现象,并且粒径较小的颗粒越易聚集。为避免分散体系对纳米二氧化钛毒性作用的影响,使用大豆油代替纯水作为分散剂进行暴露实验。
2.纳米二氧化钛诱导线虫生殖毒性。
本章研究了在不同分散系中纳米TiO2暴露对线虫生殖腺细胞死亡和后代数量的影响,结果发现纯水体系中纳米TiO2诱导细胞死亡的结果没有显著的量效关系,并且总体呈现不稳定性。而大豆油体系中100μg/mL的TiO2颗粒可显著诱导线虫生殖腺的细胞死亡,后代数量的检测结果也证明100μg/mL的TiO2颗粒对生殖腺具有显著的损伤作用。对子代细胞死亡水平的检测结果则表明纳米TiO2诱导的生殖毒性仅存在于当代,其后代未观察到显著的损伤效应。实验结果表明与纯水分散体系相比,纳米TiO2颗粒在大豆油分散系中更能引起线虫生殖腺的损伤,同时也说明了粒径较小的颗粒能够诱导更显著的损伤效应。
3.纳米二氧化钛引发细胞死亡的基因调控机制。
为验证纳米TiO2诱导的线虫生殖细胞死亡属于细胞凋亡的范畴,用100μg/mL5nm TiO2处理缺失细胞程序性死亡关键基因的线虫品系ced-3(n717)和ced-4(n1162),检测其生殖腺细胞死亡水平。结果表明纳米TiO2诱导的细胞死亡现象在上述品系中均被抑制,说明其属于细胞程序性死亡的范畴,并且与caspase途径有关。另外,对缺失促凋亡因子egl-1(n487)、clk-2(mn159)、cep-1(w40)品系的暴露结果表明纳米TiO2诱导的细胞凋亡是DNA损伤应答的结果。
4.活性氧自由基(ROS)在纳米二氧化钛诱导细胞凋亡中的作用。
为研究自由基物质对纳米TiO2诱导的线虫生殖腺细胞凋亡的影响及其机理,使用自由基清除剂与纳米TiO2共同处理线虫,发现清除剂DMSO和NaN3可显著恢复细胞凋亡水平;定量检测的结果显示100μg/mL5nm TiO2可诱导ROS含量上升至对照组的170％。进一步研究显示纳米TiO2暴露显著诱导sod-3::gfp转基因线虫SOD-3水平升高,产生显著的氧胁迫效应。研究结果揭示了纳米TiO2暴露会对线虫产生氧化应激,并且主要与超氧阴离子(Oz-·)和单线态氧(1O2)的产生相关。