研究目的和意义构建中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)受体结合区(RBD)特异性纳米抗体噬菌体文库,通过噬菌体展示技术筛选出RBD特异性纳米抗体分子。对筛选的特异性纳米抗体分子进行不同表达形式的设计,比较不同表达形式纳米抗体分子的生物学活性与功能差异,并对筛选出的纳米抗体分子进行系统评价,为开发有效的抗MERS-CoV纳米抗体药物奠定研究基础。研究方法使用MERS-CoV RBD重组蛋白免疫羊驼,采集免疫后羊驼外周血并分离单个核细胞(PBMC)提取总RNA。使用简并引物通过PCR扩增重链抗体的重链可变区(VHH)基因片段并连接p CANTAB5e载体将连接产物转化TG1感受态大肠杆菌株,构建特异性纳米抗体噬菌体文库。以RBD重组蛋白为抗原,通过噬菌体展示技术进行纳米抗体分子的筛选。对筛选出的纳米抗体分子Nano10进行不同形式的设计与表达:将Nano10片段与人IgG1 Fc片段进行融合表达,以期形成二聚体结构的纳米抗体分子10-Fc;将不同拷贝的Nano10分子通过柔性linker串联形成二联体和三联体抗体分子。利用毕赤酵母对不同表达形式的纳米抗体进行重组表达,并利用抗体分子携带的组氨酸标签或Fc分子进行纯化,获得4种不同形式的纳米抗体:Nano10单体分子(10-his)、Nano10与Fc融合蛋白(10-Fc)、Nano10二联体分子(10-2)和三联体分子(10-3)。通过间接ELISA和表面等离子共振(SPR)技术检测4种形式的纳米抗体与MERS-CoV抗原的反应性和亲和力;通过假病毒与活病毒中和试验,验证不同改造形式的纳米抗体的体外中和活性;通过流式细胞术检测抗体分子阻断MERS-CoV RBD分子与细胞表面病毒受体分子结合的效果,明确抗体发挥中和作用的方式;利用MERS-CoV敏感小鼠模型(hDPP4转基因小鼠)进行体内保护效果评价,筛选出具有良好体内外活性的候选纳米抗体分子。对筛选出的抗体分子进一步进行功能研究。(1)采用对MERS-CoV RBD抗原进行定点突变,解析候选抗体分子识别的关键中和位点,分析抗体改造对识别位点的影响。(2)利用符合不同年代不同地区MERS-CoV分离株RBD序列特征的MERS-CoV假病毒进行抗体中和试验,反映候选纳米抗体分子对MERS-CoV不同时期和地区毒株的交叉中和活性。(3)将纳米抗体在不同的温度条件下放置不同时间后,通过病毒中和试验、流式细胞受体结合与阻断试验来评价候选纳米抗体分子的耐热稳定性。(4)通过检测注射纳米抗体后不同时间点小鼠血清中纳米抗体残留情况,分析候选纳米抗体体内代谢特征和抗体稳定性。(5)利用MERS-CoV感染致死模型,评价候选纳米抗体在预防和治疗中的体内保护作用。研究结果本研究构建了MERS-CoV RBD特异性纳米抗体噬菌体文库,并利用RBD重组蛋白筛选到具有较高亲和力的纳米抗体分子Nano10。设计了4种不同表达形式的纳米抗体分子(10-his、10-Fc、10-2、10-3),利用毕赤酵母表达系统成功制备并纯化了4种纳米抗体分子。ELISA结果表明,4种形式的纳米抗体分子与MERS-CoV重组抗原均具有良好的结合活性;通过表面等离子共振(SPR)技术分析纳米抗体分子亲和力,结果表明经过改造后的纳米抗体分子具有更好的抗原亲和力。4种形式的纳米抗体分子均具有良好的体外抗病毒中和活性,流式受体结合与阻断试验结果表明抗体分子能够有效阻断病毒RBD蛋白与细胞表面受体分子的结合,表明抗体是通过阻断病毒RBD与细胞表面受体分子的结合来发挥中和活性的。尽管不同设计的纳米抗体具有良好的体外活性,但在体内攻毒保护性试验中,只有纳米抗体分子10-Fc表现出对致死剂量攻毒的h DPP4转基因小鼠的完全保护作用,表明将纳米抗体VHH片段与人Ig G1 Fc片段融合表达形成的二聚体抗体分子具有更好的抗病毒活性。进一步对纳米抗体的中和表位解析发现,位于病毒RBD上539位的天冬氨酸是纳米抗体识别的关键中和位点,纳米抗体的改造未影响识别该位点。序列比对发现,Asp539在目前MERS-CoV分离株中高度保守,利用RBD突变体假病毒进行中和试验发现,纳米抗体10-Fc对不同地区不同年代的MERS-CoV假病毒均具有良好的中和活性,表明候选纳米抗体对不同MERS-CoV毒株具有交叉中和活性。体外实验表明,纳米抗体在60℃放置7 d仍能保持良好的中和活性;体内代谢实验发现,纳米抗体分子10-Fc体内代谢稳定性显著高于单体抗体分子10-his。在体试验表明:MERS-CoV致死性感染前3 d、感染后1 d或3 d分别对hDPP4转基因小鼠腹腔注射10 mg/kg纳米抗体分子10-Fc,均能对hDPP4转基因小鼠的完全保护,说明纳米抗体10-Fc具有良好的预防和治疗作用。研究结论本研究利用建立的MERS-CoV RBD特异性纳米抗体噬菌体文库筛选得到的抗体分子进行不同形式的改造,并利用毕赤酵母表达系统成功对候选纳米抗体分子进行表达。通过比对分析,明确了不同形式的候选纳米抗体的抗原反应性、亲和力、病毒中和活性、病毒与受体结合阻断效果、体内保护作用。并在此基础上,进一步明确了IgG1Fc融合形式的纳米抗体分子10-Fc不仅保持了原有纳米抗体VHH单体分子的表位特征,而且能有效的提高抗体的稳定性与保护活性,更好地发挥免疫保护作用。该研究提出了有效的纳米抗体分子改造与优化策略,为进一步发展抗MERS-CoV保护性抗体及疫苗的研发奠定了基础。