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牛支原体(Mycoplasma bovis, M.bovis)是引起奶牛及肉牛多种疾病的重要病原菌。由于牛支原体引起的疾病没有典型症状,且常与其他致病菌混合感染,病情复杂,所以极易被忽视。随着科技的进步以及对该病的不断探索,人们越来越意识到牛支原体的危害性。自1961年首次分离到牛支原体以来,世界上大多数国家都已经发生过牛支原体相关疾病的暴发。到目前为止,没有很好的药物来治疗牛支原体引起的肺炎、乳房炎、关节炎等相关疾病。疫苗的应用也只停留在传统的灭活疫苗,且效果并不理想。2008年我国首次报道了牛支原体肺炎的暴发,经济损失惨重。由于我国养牛模式使牛在不同区域间频繁调动,加速牛支原体的传播,造成了牛支原体病在各个地区不断的暴发,给养牛业造成巨大经济损失本课题根据牛支原体特异性基因uvrC建立了一种环介导等温核酸扩增检测方法,为牛支原体病的快速诊断提供方法。同时通过体外连续传代的方法对牛支原体野毒株进行致弱,并进行毒力评价,从而为研究牛支原体毒力因子及弱毒疫苗奠定基础。具体的研究内容如下：1.牛支原体环介导等温扩增方法的建立环介导等温扩增(loop mediated isothermal amplification, LAMP)是在恒温条件下对目的基因扩增,该方法特异性好、灵敏度高,时间短、操作简单。根据牛支原体特异性基因uvrC设计出LAMP所需的四条引物,建立了牛支原体LAMP检测方法。该方法有很好的特异性,与其他支原体及呼吸道常见菌无交叉反应。该方法检测牛支原体的灵敏度可以达到34 CFU,比普通PCR高10倍。在对98份临床样本的检测中,LAMP有较高的检出率,其中对发病牛临床样本的阳性检出率为92%,而PCR的阳性率为49%；在39份健康牛样本中,LAMP和PCR的的检测结果均为阴性。本研究建立的牛支原体LAMP检测方法较传统的PCR灵敏性更更高检测时间短,且适合于临床样本的检测。2.牛支原体体外传代致弱菌株的特性鉴定将牛支原体临床分离株MbovHB0801做为原代菌株进行传代培养。MbovHB0801株已经通过前期实验充分证明其为牛支原体,且有较强的致病性。比较F115代与F1代菌株生长曲线无显著差异,通过SDS-PAGE及Western blot比较有多处蛋白条带产生差异性。用F1、F115、F150.1和F150.2四个不同代次的菌株按10’0CFU、1011CFU、3×1011CFU三个不同的感染量来感染牛,通过观察临床症状,测定体温、血常规、血清抗体、血清IFN-β和IFN-7以及鼻拭子排菌等指标评价菌株的毒力和免疫原性。结果发现,150代的菌株毒力已经降低,临床症状轻微,其中F150.2代效果最显著。F150.2代菌株感染牛体重较F1代菌株感染牛体重有显著增加(P<0.01),肺部病变打分较低,与对照组差异不显著(P>0.05),而与F1代感染组有较显著差异(P<0.05),血常规指标表明接种牛不发生严重的炎症反应,且可以很好的诱导抗体反应,感染后6天IFN-β值可以达到414pg/mL,与Fl代感染组相当。综合比较,该代次菌株毒力较弱且保持良好的的免疫原性,提示该弱毒菌株可作牛支原体弱毒疫苗的侯选菌株,为牛支原体新型疫苗的研发奠定了基础。