绵羊痘是由绵羊痘病毒(Sheep pox virus,SPPV)引起的一种急性、烈性、高度接触性传染病,可使患病绵羊的劳动力丧失、产奶量和产毛量降低、妊娠母羊流产等,严重时可引起死亡。绵羊痘的传播流行给世界各地的养殖业和贸易往来带来了严重经济损失,被世界动物卫生组织(Office International Des Epizooties,OIE)列为必报动物疫病之一,也是我国重点防控的一类疫病。疫苗接种是防控绵羊痘的主要手段,但传统疫苗存在诸多限制性,灭活疫苗的免疫原性弱且不能提供细胞免疫应答,弱毒疫苗免疫效果虽好,但免疫后会导致机体出现痘痕、妊娠母羊流产等现象,安全性较差。因此,研制一种安全、高效的新型疫苗对绵羊痘的防控至关重要。病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)是由病毒的结构蛋白组装而成的纳米级空心颗粒,与真实病毒形态大小十分相似且不含有病毒的感染性核酸,安全性较高。VLPs具有独特的立体结构,颗粒表面展示了高密度、重复有序的抗原表位,极易被抗原递呈细胞摄取,可诱导产生高效的免疫应答。而且,VLPs允许外源蛋白的插入而不影响其组装,是一种良好的疫苗载体平台。本研究以新城疫病毒样颗粒为载体,利用昆虫杆状病毒表达系统,通过GPI锚定策略将绵羊痘重要保护性抗原蛋白P32蛋白嵌合至新城疫病毒样颗粒囊膜表面,构建嵌合型病毒样颗粒cVLPs P32,并以BALB/c小鼠和绵羊为实验动物,从体液免疫和细胞免疫两方面对颗粒疫苗的免疫效果进行评价。为绵羊痘的防控提供安全、有效的新型疫苗候选株。主要内容如下:一、吉林省农安某种羊场绵羊痘病毒分离及鉴定2014年12月份,吉林省农安某种羊场绵羊突然出现体温升高、精神萎靡、呼吸困难、脉搏增数、结膜潮红等现象,口角和鼻孔周围有大量黏液分泌,口腔出现溃疡,尾根、乳房、阴唇等毛发较少部位出现大小不等的红色斑点或痘疹,符合绵羊痘临床症状,进一步剖检可见,在肺脏表面出现大量灰白色痘疹结节,同时心脏、脾脏及胃黏膜也出现病变。肺部病理组织学结果显示部分肺泡壁上皮细胞可见嗜酸性的病毒包涵体,支气管黏膜上皮细胞发生增生和化生现象,且有部分黏膜发生脱落;脾脏病理组织学结果显示鞘动脉周围可见淋巴细胞浸润。采集病死羊肺脏样品,匀浆离心处理后进行电镜负染观察,透射电镜可观察到圆形或卵圆形的典型绵羊痘病毒粒子。进一步利用OFTu细胞分离病毒,扩增绵羊痘病毒RPO30、P32、Kl基因,与GenBank中绵羊痘病毒和山羊痘病毒相应序列比对分析,结果显示吉林分离株RPO30基因缺失21bp,并且K1基因902-925bp区域也存在缺失;系统发育进化树显示吉林分离株P32基因虽与GenBank公布的绵羊分离株(AY077834)同源性较高,但已形成独立的系统进化分支。二、嵌合病毒样颗粒cVLPs P32的构建本研究基于新城疫病毒样颗粒的载体平台及GPI蛋白锚定策略,通过昆虫杆状病毒表达系统构建嵌合病毒样颗粒cVLPs P32。将绵羊痘P32基因胞外域和pFastBac1-GPI连接构建重组穿梭质粒pFastBac1-GPI-P32,转化至DH10bac中,经多次蓝白斑筛选,构建重组杆粒rBmid-GPI-P32,转染至贴壁sf9细胞,盲传三代后获得rBV-GPI-P32,按照MOI=5(1:1)将rBV-GPI-P32与本室冻存的rBV-M接种于细胞密度为2×10~6个/mL sf9的悬浮细胞中,27℃培养72-96h后,利用超速离心及蔗糖密度梯度纯化嵌合病毒样颗粒cVLPs P32。透射电镜结果显示,cVLPs P32可见典型的新城疫M蛋白聚合而成约100nm左右的空心纳米颗粒;免疫印迹分析结果显示P32蛋白和新城疫M蛋白均正确表达,表明cVLPs P32组装正确。三、嵌合病毒样颗粒cVLPs P32免疫效果评价采用小鼠模型评价cVLPs P32的免疫原性,并回归亲本动物评价cVLPs P32的免疫效果。通过间接ELISA检测小鼠血清抗体,结果表明嵌合病毒样颗粒cVLPs P32能够比可溶性GPI-P32蛋白更早的激发体液免疫,且诱导的抗体水平明显更高,但5μg cVLPs P32诱导体液免疫应答能力与10μg cVLPs P32相当;与之相符,通过流式细胞术分析小鼠脾脏T淋巴细胞亚型,结果显示cVLPs P32诱导初始型T淋巴细胞向CD3~+CD4~+T及CD3~+CD8~+T淋巴细胞分化的能力显著优于可溶性P32蛋白。绵羊免疫效果显示,嵌合病毒样颗粒cVLPs P32可诱导绵羊产生较高的总IgG抗体和针对P32蛋白的特异性抗体。综上,本研究成功构建以新城疫病毒样颗粒为载体,囊膜外展示绵羊痘保护性抗原蛋白P32蛋白的嵌合病毒样颗粒cVLPs P32,免疫后可诱导高水平的细胞免疫应答和体液免疫应答,为绵羊痘的防控奠定基础。