背景和目的:肺癌的发病率、死亡率呈逐年上升趋势,而其发病年龄出现了下降的趋势。近年来,随着肺癌相关领域的基础研究的逐步深入、临床诊断治疗策略不断改进,越来越多患者得到了更规范的治疗,使肺癌的诊治率有了很大的提升。然而,由于肺癌的高侵袭性,患者一旦出现转移,将面临极大的死亡风险。而现有的诊断技术对于肺癌诊断、判断预后、指导治疗等方面存在一定的局限性,患者确诊时往往已失去最佳的治疗机会。因此,如何提高肺癌患者的检出率是临床亟待解决的难题。为了克服传统检测手段的不足,近年来,循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells,CTCs)的研究逐渐深入。其重要原因在于,CTC检测可作为一种“液态病理活检”技术,有助于临床明确诊断、评估转移、判断预后、指导个体化治疗。同时,CTC检测技术具备无创、操作简单、可重复、顺应性好等优势,更易被临床患者接受。但是,由于CTC数目微少,高效分选具有一定的挑战性。随着微流控技术对细胞生物学的影响不断加深,以及对处理及分析血液类样本的优势,非常适用于血细胞、癌细胞等体细胞的分选。近年来基于微流控芯片技术在CTC分选领域获得了一系列进展,根据分离原理的不同,主要分为两大类,一类是基于物理学特性的分选,另一类是基于生物学特性。前者主要是依据肿瘤细胞与血细胞的大小不同、密度不同、所带电荷不同等方法将CTC从外周血中分选。优点是操作简单、成本低、高通量等,但缺点是检测效率相对较低、纯度较差。后者主要是依据免疫学反应,通过CTC表面特异性表达的蛋白将其与血细胞分开,优点是检测效率较高,但通量较低、检测纯度通常不高。因此,基于微流控芯片技术,本研究构建了一个快速、高效的CTC检测装置,并将该装置用于了临床患者CTC的检测分析。首先,我们通过对标准细胞株及临床患者外周血标本CTC的检测,以及与CellsearchSystem的效能比较,验证了该装置的可靠性。其次,我们将该装置用于肿瘤患者CTC的检测,分析CTC数目与肿瘤分期、肿瘤转移及患者病情的关系。最后,为了进一步探讨与肺癌转移相关的机制,我们对高转移与低转移能力的肺癌细胞株进行了单细胞分选和转录组测序分析,比较了高转移组及低转移组单个肺癌细胞转录组表达的差异,初步筛选得到与肺癌转移相关的基因TSPAN6、CFH、GCLC、HS3ST1。本人所在课题后续研究中将对该4个基因的功能进行验证。同时,基于细胞株水平的单细胞分析为后续肺癌患者水平的单个CTC分析奠定了基础。研究方法:1.基于微流控芯片的肺癌CTC检测装置的构建基于微流控芯片技术,构建了一个集成化的CTC检测装置,集合了三种检测方法的优势,同时弥补了各自的不足。装置分为三部分,第一部分是基于细胞尺寸大小的不同构建了CTC分选平台;第二部分是基于磁场的负性分选构建了CTC纯化平台;第三部分是基于免疫亲和反应构建了CTC捕获平台。2.基于微流控芯片的CTC检测装置效能验证本部分研究分别从标准细胞株检测、肿瘤患者外周血CTC检测以及与CellSearch System的检测效能对比三方面验证该装置的效能。标准细胞株检测实验:首先,选取不同数目的肺腺癌细胞株H1299-GFP加入健康人外周静脉血中,模拟5个不同浓度的患者样本(10~1/mL-10~5/mL),分别经过芯片检测后,计算装置的检测率及检测纯度。然后分析装置对细胞活性的影响,分别将检测得到的细胞与对照组细胞通过Hochest/PI双染实验比较细胞的存活率。因此,通过对标准细胞株的检测,进而评价该装置的检测率、检测纯度及对细胞活性的影响。临床患者CTC检测实验:将临床患者外周血标本通过芯片装置检测CTC。同时,结合患者的病情分析,进一步验证该装置的可靠性。最后,比较芯片装置与CellSearch System对肿瘤患者CTC的检测结果,通过t检验分析检测结果是否存在差异,进而验证芯片装置的检测效能。3.基于微流控芯片的CTC检测装置临床应用分析55例肿瘤患者外周血的CTC检测结果,结合患者病情及相关临床检查结果,分析CTC数目与肿瘤分期、肿瘤转移、患者病情的关系。4.单细胞转录组测序分析及肺癌转移基因的筛查我们首先在细胞株水平进行相关实验,为后续的患者CTC单细胞分析奠定基础。选取肺癌高转移能力细胞株95-D及低转移能力细胞株SPCA-1,通过RNA-seq分析高转移与低转移能力的单个肺癌细胞转录组水平的差异,筛查与肺癌转移相关的基因,后续实验对该基因的功能进行验证。结果:1.基于微流控芯片的肺癌CTC检测平台的构建本研究构建的CTC检测平台主要由三部分构成。首先,是基于细胞尺寸大小不同而设计的DLD分选芯片,通过对芯片不同尺寸参数的尝试,主要是芯片通道的长、宽、高,以及三角形微柱及其微柱间临界值,最终选定芯片通道长为68 mm,宽为3.5mm,高为50μm,三角形微柱间的临界值为6.75μm为最优参数,在此参数下的肿瘤细胞株分选率可达90%。之后,基于磁场负性的分选构建了自动的纯化装置,通过对不同纯化时间、磁珠/细胞比例的尝试,最终选定反应时间为20min,磁珠/细胞为10:1,在此条件下,白细胞去除率可达80%以上。最后,CTC被捕获在胶原蛋白包被的孔板上,并通过免疫荧光化学反应被鉴定。2.基于微流控芯片的CTC检测装置效能验证为了验证该装置的检测率、检测纯度及检测后的细胞活性。首先,我们模拟患者样本,将H1299-GFP细胞株加入健康人外周血,模拟5个不同浓度的肺癌患者样本,检测结果证实该装置可在1mL/min速度下,检测效率可达90%,检测纯度可达50%。通过对细胞活性的检测,我们发现该装置对细胞的活性无明显影响,活细胞比例可达90%,与对照组无明显差异,并且可进行后续的细胞培养、增殖与传代。然后,我们通过对15例临床晚期肺癌患者及2例健康人外周血样本进行CTC检测,结果发现15例患者中,12例CTC检出率为阳性,阳性率为80.0%,而健康人中CTC检出率为0,排除了实验结果的假阳性。最后,我们将芯片装置与CellSearch System对肿瘤患者CTC检测结果进行对比,通过t检验分析,p>0.05,差异无统计学意义,即本研究构建的芯片装置在检测效能上与CellSearch System无明显差异。3.基于微流控芯片的CTC检测装置临床应用通过对55例患者CTC检测结果分析,探究CTC数目与患者的肿瘤分期、肿瘤转移及患者病情的关系。发现对于14例早期(I、II)患者,CTC检出率为7.1%,相反对于41例晚期(III、IV)患者检出率为68.3%。而对于检测结果为阳性的29例患者中,28例存在明确转移。同时,我们分析了CTC数目与患者病情的关系,发现病情复发或进展的患者,CTC检出率通常为阳性。病情缓解或稳定的患者,CTC检出率通常为阴性。因此提示CTC数目与肿瘤分期、肿瘤转移及患者病情相关。4.单细胞转录组测序分析与肺癌转移基因的筛查为了进一步探究与肺癌转移相关机制,本部分通过单细胞分选及RNA-seq技术筛查与肺癌转移相关基因。首先,在细胞株水平,通过芯片肿瘤细胞捕获装置及毛细管采集的方法分选得到了高转移能力的肺癌单细胞95-D及低转移能力的肺癌单细胞SPCA-1。然后,通过RNA-seq技术比较二者的转录组水平差异,筛选得到与肺癌转移相关基因TSPAN6、CFH、GCLC、HS3ST1。本人所在课题组在后续研究中将对该4个基因的功能进行验证。同时,细胞株水平的单细胞测序将为后续的肺癌患者水平的单个CTC测序分析奠定基础。结论:1.基于微流控芯片技术,本研究构建了一个适于肺癌CTC检测的装置,该装置集合三种分选方法的优势,可实现快、高效的CTC检测。2.通过对标准细胞株检测、肿瘤患者外周血CTC检测,以及与CellSearch System检测效能的比较,证实该装置检测效能高、检测结果可靠。3.通过分析肿瘤患者CTC检测结果,提示CTC数目与肿瘤分期、肿瘤转移及患者病情相关。4.通过肺癌单细胞转录组测序分析,筛选得到与肺癌转移相关基因TSPAN6、CFH、GCLC、HS3ST1。后续实验将对该基因功能进行验证。