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植酸是植物性饲料中磷的主要存在形式,在谷物和豆类中其含量超过总磷的80%,磷是动植物生长发育不可缺少的重要元素之一。植酸酶是一种能够水解植酸并释放无机磷的磷酸酶类,广泛存在于植物及微生物中,它作为单胃动物的饲料添加剂已得到了世界范围内的广泛认可。单胃动物的胃、肠道环境中因缺乏植酸酶或植酸酶活性很低导致不能分解植酸而释放其中的无机磷,植酸能够螯合植物营养因子降低其利用率,导致必须向饲料中添加营养因子以满足其生长发育的需要,从而造成成本增高和带来环境污染等影响。通过向动物饲料中添加植酸酶就可以缓解这一问题。来自于大肠杆菌的appA植酸酶是一种新型的植酸酶,它在单胃动物胃肠道的酸性环境中适应能力和分解植酸的能力都很强,而且,appA植酸酶还是目前已知的活性最强的植酸酶。本研究采用维生素C-钼蓝法从饲喂青饲料的猪粪便中筛选到一株高产appA植酸酶活性的大肠杆菌菌株,并根据已报道的基因序列设计一对特征性PCR引物,克隆到了该植酸酶appA基因。DNA测序结果表明,本研究所克隆到的植酸酶基因片段与已报道的appA植酸酶基因具有较高的同源性,该植酸酶appA基因阅读框大小为1233 bp,编码411个氨基酸,其表达产物理论分子质量(MW)和等电点(pI)分别为44.821 kDa和6.09,(G+C)%含量为54.60%。氨基酸结构分析表明该appA植酸酶具有与酸性磷酸酶相同的活性保守基序RHGxRxP和催化活性中心HD,并且存在有3个潜在N-糖基化位点。为获得大量的appA植酸酶,我们将appA基因克隆到甲醇营养型巴斯德毕赤酵母GS115中进行诱导表达,经PCR阳性鉴定和酶活性测定,筛选到了一株能够表达较高酶活性的appA植酸酶基因工程菌GS115/appA,通过SDS-PAGE凝胶电泳检测表达产物,得到一条约55-60 kDa的特征条带。表达蛋白经Ni亲和柱纯化,其appA植酸酶比活力为2669.46U/mg,分子量约57.2 kDa。酶学性质分析表明,重组appA植酸酶的最适温度和最适pH分别为55℃和pH3.0,热稳定性表现为热处理温度高于60℃,appA植酸酶活性开始降低,随着处理时间的延长,酶活不稳定性表现越明显。