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目的:探讨Vγ9Vδ2 T细胞对未成熟树突状细胞(immature dendritic cell,imDC)向破骨细胞(osteoclast,OC)转分化的调控作用,筛选出相关的关键基因和信号通路,研究骨髓瘤环境下Vγ9Vδ2 T细胞对imDC向OC转分化的调控作用。方法:1、研究Vγ9Vδ2 T细胞对imDC向OC转分化的影响:(1)细胞培养:(1)Vγ9Vδ2 T细胞体外扩增培养:应用唑来膦酸(Zoledronic acid,ZOL)和重组人IL-2(recombinant human interleukin 2,rh IL-2)体外培养外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMNCs)并扩增Vγ9Vδ2 T细胞;(2)imDC细胞体外诱导培养:免疫磁珠分离出的CD14+PBMNCs,在重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,rh GM-CSF)和重组人白介素-4(recombinant human interleukin 4,rh IL-4)诱导培养下转分化为imDCs;(3)共培养体系建立:采用Transwell分层法建立Vγ9Vδ2 T细胞(上室)-imDC(下室)共培养体系(作为γδT组),应用重组人巨噬细胞集落刺激因子(recombinant human macrophage colony-stimulating factor,rh M-CSF)和细胞核因子B受体活化因子配基(recombinant human receptor activator nuclear factorкB ligand,rh RANKL)诱导培养imDC向OC转分化,以imDC在rh M-CSF和rh RANKL诱导培养基中单独培养作为对照组;(2)干预方式:(1)不同细胞比例共培养:Vγ9Vδ2 T和imDC的细胞数比分别以10:1、1:1和1:10共培养;(2)不同干预时间共培养:以imDC开始培养时即与Vγ9Vδ2 T细胞共培养24小时(细胞比例为1:1)为早期共培养(d 0-1γδT)组,培养第3天时再和Vγ9Vδ2 T细胞共培养24小时为d 3-4γδT组、连续共培养为d 0-4γδT组,继续在rh M-CSF和rh RANKL诱导基中培养;(3)破骨细胞数目、功能及相关基因检测:抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)染色和甲苯胺蓝染色,计数TRAP阳性的OC数目,测量牙本质片的骨吸收陷窝面积。Real-time RT-PCR和Western blot检测CTR和MMP9表达。2、研究imDC与Vγ9Vδ2 T细胞分层共培养后转分化OC的m RNA表达谱改变:以imDC在rh RANKL和rh M-CSF诱导培养基中单独培养为对照组;Vγ9Vδ2 T细胞和imDC以1:1的细胞比分层共培养24小时,为γδT组;两组培养第9天应用Affymetrix m RNA表达谱芯片检测基因表达差异;生物信息学分析基因调节网络及信号通路;Real-time RT-PCR检测Vγ9Vδ2 T细胞抑制imDC向OC转分化过程中关键基因的表达情况。3、研究骨髓瘤环境下Vγ9Vδ2 T细胞对imDC向OC转分化作用:以imDC在rh RANKL和rh M-CSF诱导培养基中单独培养为对照组;RPMI8226细胞培养48小时后,收集培养上清,作为多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)条件培养基(conditioned medium,CM)和rh RANKL和rh M-CSF联合诱导培养imDC,作为MM-CM组;建立Vγ9Vδ2 T细胞(Transwell上室)和MM-CM-imDC(下室)分层共培养体系,作为γδT-MM-CM组。Real-time RT-PCR、Western blot和免疫荧光检测OC转分化相关基因RANK、Cathepsin K、ATP6V0D2、c-Fos的表达水平。ELISA法检测各组细胞培养上清的CTX-I水平。结果:1、(1)TRAP染色结果示:与对照组比较,γδT组的imDC生成的TRAP染色阳性OC数目显著减少(P<0.05),Vγ9Vδ2 T细胞与imDC的比例越高,形成的OC越少,组间有显著差异(P<0.05);imDC向OC转分化的早期阶段与Vγ9Vδ2 T细胞共培养(d 0-1γδT组)生成的OC数目较对照组显著减少(P<0.05),也较d 3-4γδT组显著减少(P<0.05),但d 3-4γδT组的TRAP染色阳性的OC数目与对照组比较无明显统计学差异(P>0.05)。(2)预置的牙本质片甲苯胺蓝染色示:γδT组的骨吸收陷窝面积与对照组相比显著减少(P<0.01),Vγ9Vδ2 T细胞与imDC的比例越高,骨吸收陷窝面积比越小,组间有显著差异(P<0.01)。(3)Real-time RT-PCR和Western blot结果显示:与对照组相比,γδT组(γδT与imDC细胞数比分别为1:1和1:10)CTR和MMP9的m RNA和蛋白表达水平均显著降低(P<0.01)。2、m RNA表达谱芯片结果及生物信息学分析显示与单独培养的imDC比较,与Vγ9Vδ2 T细胞共培养的imDC有显著差异性表达的基因共有293条,其中表达上调的m RNAs有123条,表达下调的m RNAs有170条。GO和KEGG功能富集分析结果发现差异基因与破骨细胞转分化、免疫调节以及细胞因子相互作用等生物学过程相关。显著差异基因中FCGR3A、FCGR3B、BTK、FOSL2、ATP6V0D2、BTUK、CTSK与OC转分化过程相关。Real-time RT-PCR结果显示与对照组相比,γδT组的RANK、Cathepsin K、c-Fos、ATP6V0D2、MMP9、CTR基因水平显著降低(P<0.05)。3、(1)TRAP染色结果示:与对照组相比,MM-CM组的TRAP阳性OC数目显著增加(38.81±3.78 vs 30.52±1.89,P<0.01);而γδT-MM-CM组的TRAP染色阳性OC较对照组显著减少(10.93±2.08 vs 30.52±1.89,P<0.01);(2)甲苯胺蓝染色结果示:与对照组相比,MM-CM组牙本质片上的骨吸收陷窝面积显著增加(0.45±0.13 vs 0.31±0.08,P<0.01),γδT-MM-CM组的骨吸收陷窝面积较对照组显著减少(0.04±0.01 vs 0.31±0.08,P<0.01);(3)与对照组相比,γδT-MM-CM组的RANK、c-Fos、ATP6V0D2和Cathepsin K的m RNA和蛋白表达水平显著降低(P<0.01);(4)γδT-MM-CM组c-Fos的荧光强度较MM-CM组显著下降(P<0.05);(5)与对照组相比,MM-CM组上清的CTX-1水平显著升高(P<0.01),而γδT组显著降低(101.24±19.31 vs 326.73±29.67,P<0.01)。结论:1、成功建立Vγ9Vδ2 T细胞和imDC的Transwell分层共培养组体系,ZOL和rh IL-2体外诱导扩增的Vγ9Vδ2 T细胞可抑制imDC向OC转分化及OC的重吸收功能,Vγ9Vδ2 T细胞对OC的抑制作用呈现细胞数量依赖性,而且imDC向OC转分化的早期阶段受Vγ9Vδ2 T细胞的抑制作用更为敏感。2、全基因m RNA表达谱芯片筛选出Vγ9Vδ2 T细胞抑制imDC向OC转分化及重吸收功能的相关基因有BTK、c-Fos、ATP6V0D2、Cathepsin K。3、MM条件培养基可促进imDC向OC转分化,其溶骨作用更强,可以模拟骨髓瘤微环境;Vγ9Vδ2 T细胞在MM环境下可能通过下调RANK、c-Fos、ATP6V0D2、Cathepsin K抑制imDC转分化为OC,并抑制了OC重吸收功能。