论文部分内容阅读
目的:空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni,C.jejuni)是一种微需氧的革兰氏阴性弯曲短杆菌,是世界范围内感染性腹泻常见的病原菌。急性、自限性肠炎是Cdejuni感染后的典型表现,某些类型C.jejtmi菌株感染后还可引起自身免疫性疾病——吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barré syndrome,GBS)。C.jejuni被认为是GBS最重要的前驱感染病原。C.jejuni菌体表面的脂寡糖(lipooligosaccharide,LOS)结构与周围神经的神经节苷脂之间由于形态相似可发生分子模拟导致交叉免疫损伤是C.jejuni感染后发生GBS的主要机制。cstⅡ基因编码alpha2,3/8-唾液酸转移酶,将唾液酸转运至LOS末端糖链从而产生唾液酸化的LOS,对产生多种形态的LOS至关重要。
本研究通过序列比对获得3株GBS相关C.jejuni的cstⅡ基因序列,并与GeneBank中GBS无关C.jejuni相应基因序列进行配对对比,寻找可能与GBS致病性相关的基因突变和蛋白高级结构变化,并观察这种变化是否在其他GBS相关菌株中同样存在,了解GBS相关C.jejuni的cstⅡ序列特征,并分析其遗传进化关系。
方法:选取分离自河北医科大学第二医院神经内科GBS患者粪便并经动物模型证实为致GBS的3株C.jejuni菌株:lulei株,qiaoyuntao株,zhanxing株进行培养,其血清型分别为penner O:19型,penner O:2型,penner O:5型。应用Wizard基因提取试剂盒提取C.jejuni基因组DNA。将菌株基因组DNA送至Analytical Genetics Technology Centre,UniversityHealth Network,Toronto Princess Margaret Hospital进行测序。从NCBI数据库获得3株GBS无关的C.jejuni的cst-Ⅱ基因序列及5株GBS相关的C.jejuni的cst-Ⅱ基因序列,用DNASTAR-MegAlign软件,以ClustalW命令对所得的C.jejuni株的cstⅡ基因片段做核酸,氨基酸及氨基酸二级结构的多序列比对,寻找两种菌株间可能导致C.jejuni致病能力差异的碱基突变及其高级结构改变,分析其致GBS的可能机制,并构建遗传进化树。
结果:3株致GBS的Cjejuni菌株cst基因均由876个碱基构成。与GBS无关的cstⅡ基因序列相比,qiaoyuntao株,lulei株,和zhanxing株分别有9,19和3个碱基突变,依次导致3,7,1个氨基酸突变。其中,lulei株与qiaoyuntao株共有9个相同的碱基突变:342位碱基A→T,544-546位碱基CCC→AAT,805位碱基G→A。导致了3个相同的氨基酸突变:114位氨基酸E→D,182位氨基酸R→N,269位氨基酸V→I。在这三个相同的氨基酸突变中,114位和182位氨基酸突变在其他GBS相关菌株中同样存在。Zhanxing株cstⅡ的氨基酸突变:169位氨基酸E→G位于182位氨基酸附近。三株本地菌株cstⅡ基因的氨基酸序列二级结构的第七个α螺旋长度均短于GBS无关菌株在该位置(165～180区段)的α螺旋,而其被打开的α螺旋均形成了折叠或转角,体现了共同的变化趋势.,而该变化在其他GBS相关菌株的二级结构变化中同样得到体现。
75％的GBS相关菌株cstⅡ基因51位氨基酸为天冬酰胺(Asn,N),表达双功能唾液酸转移酶。25％GBS相关菌株及所有GBS无关菌株cstⅡ基因51位氨基酸为苏氨酸(Thr,T),表达单功能唾液酸转移酶。
遗传距离计算,lulei株与qiaoyuntao株相似度98.4％,遗传距离1.6％,与其他菌株遗传距离0％～2.8％;zhanxing株与lulei株相似度97％,遗传距离3.0％,与其他菌株遗传距离0.3％～3.O％,qiaoyuntao株与zhanxing株相似度98.6％,遗传距离1.4％,与其他菌株遗传距离1.0％～1.6％。
结论:三株本地菌株cstⅡ基因的氨基酸二级结构的165～180区段体现了共同的变化趋势.,而该变化在其他GBS相关菌株的二级结构变化中同样存在。这种GBS相关菌株在氨基酸二级结构上的共同变化趋势提示该区段可能为使菌株具有致GBS能力的责任区段。该区段高级结构的改变很可能影响了唾液酸转移酶的功能活性从而改变神经节苷脂表位的形态,使得C.jejuni菌株获得GBS致病性。本研究中涉及的大部分GBS相关菌株的cstⅡ基因均表达双功能唾液酸转移酶,而GBS无关菌株的cstⅡ基因均表达单功能唾液酸转移酶,提示双功能唾液酸转移酶可能与C.jejuni的GBS致病性相关。