线粒体微粒在创伤性脑损伤相关凝血功能障碍中的作用机制研究

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目的:创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)相关凝血功能障碍(traumatic brain injury-associated coagulopathy,TBI-AC)发生和死亡率高,其发生机制尚不明确。课题组前期已发表的研究显示,小鼠TBI后损伤的神经元和神经胶质细胞可释放脑源性微粒(brain derived microparticles,BDMP)通过破坏的血脑屏障进入外周循环血中引起系统性凝血功能障碍(Blood 2015)。本研究将在此基础上,继续研究BDMP的亚型线粒体微粒(mitochondrial microparticles,mt MPs)在TBI后小鼠外周血中的含量及其在TBI-AC中的作用,并通过体外提取mt MPs,检测其对凝血相关细胞的作用。同时检测微粒清除蛋白Lactadherin对mt MPs介导的TBI-AC的治疗作用。本研究将丰富TBI-AC发病机制的理论,并探索新的TBI-AC及TBI继发性损伤的治疗方法。方法:(1)通过小鼠TBI模型,检测小鼠创伤性脑损伤后外周血抗脑抗体的变化。(2)体外实验检测心磷脂(cardiolipin,CL)的促凝活性,并通过尾静脉给予正常小鼠体内注射不同剂量的CL,检测CL在正常小鼠体内的促凝作用。通过扫描电子显微镜(scanning electron microscopy,SEM)观测CL形成胶团结构。(3)通过流式细胞术、RT-PCR和扫描电子显微镜(transmission electron microscopy,TEM)检测小鼠TBI后外周血中mt MPs的释放,同时检测CL与mt MPs的关系。(4)通过流式细胞术,免疫磁珠分选和多步离心法三种不同方法体外提取mt MPs,并通过流式细胞术和TEM对其表型和形态进行鉴定。(5)体外检测mt MPs的促凝作用,并通过小鼠尾静脉给予正常小鼠体内注射mt MPs,通过凝血因子X激活凝血时间实验,ELISA法检测外周血D-dimer含量和组织病理染色,检测mt MPs在正常小鼠体内的促凝作用。(6)通过流式细胞术和RT-PCR检测体外培养的神经元和神经胶质细胞mt MPs的释放。(7)检测mt MPs或CL是否可以激活血小板及其潜在机制。(8)检测mt MPs或CL对血管内皮细胞间屏障完整性和对内皮细胞的激活。(9)体外检测Lactadherin蛋白对mt MPs介导的促凝作用的抑制作用。结果:(1)小鼠TBI后外周血中,在伤后10天开始可检测到抗CL抗体,同时CL胶团在体内及体外具有促凝活性,其在体内可促进小鼠肺组织血管纤维素沉积和微血栓形成。(2)小鼠TBI后6h,检测到脑组织中损伤的神经元和胶质细胞系中线粒体以微粒形式,即线粒体微粒(mt MPs)释放至外周血中,其含量可达到17,547±2,677/μl,mt MPs表面暴露CL。这种mt MPs占到了整个Annexin V+微粒的55.2±12.6%。同时,体外培养的神经细胞系和胶质细胞系在凋亡状态下可释放mt MPs。体外提取的mt MPs可以协同血小板促进内皮细胞的渗漏。(3)正常小鼠经鼠尾静脉注射入mt MPs 30min后,可导致小鼠外周血呈现高凝状态,凝血酶升高,同时可在小鼠肺组织中检测到血管纤维素沉积及肺组织间水肿。(4)mt MPs介导的促凝作用主要是通过线粒体内膜上CL转移至外膜而介导的,其促凝作用可以被微粒清除系统蛋白Lactadherin所阻断,而这种mt MPs上的CL的促凝作用是相同浓度纯化的CL胶团的1600倍。Lactadherin还可以减少经mt MPs注射小鼠的死亡率。结论:(1)TBI后损伤的神经细胞释放mt MPs至外周循环血中,mt MPs表面含有大量CL(2)表面暴露CL的mt MPs具有高的促凝活性,其可以引起TBI后凝血功能障碍的发生。(3)微粒清除蛋白Lactadherin可以抑制CL和mt MPs的促凝作用,其还可以减少注射了mt MPs小鼠的死亡率。本研究揭示了一种新的表面暴露CL的mt MPs介导的TBI相关凝血功能障碍发生的机制,并初步探索了一种潜在的抑制这种促凝机制治疗TBI-AC的方法。
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