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目的:帕金森病(PD)是以中脑黑质致密部(SNc)的多巴胺（DA）能神经细胞进行性退变为主要特征的神经系统疾病。胶质细胞系源性神经营养因子（GDNF）是对SNc DA能神经细胞起特异性保护和促存活作用的神经营养因子。本室前期研究结果表明，GDNF能激活DA能神经细胞中的非经典NF-κB 信号通路，但该通路是否介导了GDNF对受损DA能神经细胞的保护作用，目前尚不清楚。本研究旨在通过RNA干扰(RNAi) 和基因过表达等分子生物学方法及流式细胞分析来探讨该通路被激活后对GDNF神经保护作用的影响。
方法:设计针对p100的RNAi序列并由公司合成，与psilencer3.1-H1载体连接构成sip100质粒，测序鉴定是否构建成功，将测序完全正确的sip100质粒转染至MN9D细胞（一种由胚胎小鼠中脑顶盖DA能神经细胞和N18TG2神经母细胞瘤细胞融合而成的细胞系，表现出中脑DA能神经细胞的明显特征），Western blot方法检测其对p100的干扰效果；其次，采用一步法从小鼠腹侧中脑组织中提取总RNA，以RT-PCR扩增野生型p100的cDNA片段，并与真核表达载体pcDNA3.1(-)连接构成重组体wtp100。将测序完全正确的wtp100质粒转染至MN9D细胞，Western blot方法检测p100的表达；接着，将sip100质粒转染至MN9D细胞，48hr后给予GDNF处理，应用Western blot方法检测胞核内p52的水平，观察RNAi的方法是否能够抑制NF-κB非经典信号通路；最后，在MN9D细胞中，分别转染sip100质粒，wtp100质粒或共转染两种质粒，应用流式细胞技术观察其对GDNF对抗6-羟多巴胺(6-OHDA)损伤作用的影响。
结果:构建的sip100质粒测序结果与预期结果一致，转染至MN9D细胞后能抑制p100的表达；构建的wtp100质粒测序结果与p100 cDNA序列完全一致，转染至MN9D细胞后p100表达增加；转染sip100质粒并给予GDNF处理后，细胞核内p52的水平没有升高；特异性阻断非经典NF-κB 信号通路后，GDNF对抗6-OHDA损伤的神经保护作用降低。
结论:成功构建了针对p100的RNAi质粒sip100和野生型p100的重组表达质粒wtp100；RNAi抑制p100的表达能特异性阻断非经典NF-κB 信号通路；非经典NF-κB 信号通路参与介导GDNF对DA能神经细胞的保护作用。