目的:应用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在sf9昆虫细胞中表达EV71 VP1蛋白，用表达纯化的VP1蛋白作为包被抗原建立ELISPOT检测EV71感染者外周血抗VP1抗体分泌细胞的方法，并评价该方法在检测EV71感染诊断中的应用价值。　　方法:(1)利用RT-PCR技术从EV71基因组扩增VP1基因。将VP1基因插入到供体质粒pFastBac1中，构建重组质粒pFastBac1-VP1，再转入E.coliDH5 a感受态细胞进行扩增。然后提取重组质粒pFastBac1-VP1，将其转入DH10BacTM（含有杆状病毒质粒和辅助质粒）感受态细胞，通过转座作用将目的基因VP1整合到杆状病毒质粒中，再通过抗性和蓝白斑筛选出重组杆状病毒质粒Bacmid-VP1，提取重组的杆状病毒质粒，以M13通用引物进行PCR鉴定。　　(2)采用脂质体Cellfectin Reagent将鉴定正确的重组杆状病毒质粒Bacmid-VP1转染sf9细胞，显微镜观察细胞变化。收获P1代病毒，用P1代病毒感染sf9细胞，观察细胞病变效应。PCR鉴定目的基因是否整合到杆状病毒质粒中。　　(3)通过SDS-PAGE及Western blot法鉴定目的蛋白的表达。经镍离子亲和层析，纯化VP1蛋白，并进行浓度及纯度测定。　　(4)用纯化的VP1蛋白作为包被抗原，建立ELISPOT检测方法，优化实验方案，包括最佳蛋白包被浓度、细胞浓度、HRP标记抗体工作浓度等。　　(5)应用ELISPOT方法检测EV71感染者外周血抗VP1抗体分泌细胞，评估重组VP1蛋白在检测EV71感染中的应用价值。　　结果:(1)RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，成功获得VP1目的基因。构建重组质粒pFastBac1-VP1转化DH10BacTM感受态细胞，阳性Bacmid-VP1重组子经M13通用引物PCR验证获取3227 bp大小的目的片段，与理论大小相符，表明成功构建了杆状病毒质粒。　　(2)重组杆状病毒质粒转染sf9昆虫细胞，48h后，细胞变大，裂解死亡，表明杆状病毒质粒转染成功。P1代病毒感染sf9细胞，诱导重组VP1蛋白表达，用VP1基因特异引物经PCR鉴定可以扩增出目的基因，表明目的基因成功整合到杆状病毒质粒中。　　(3)SDS-PAGE及Western blot检测，在36 kDa出现特异性条带，与目的蛋白大小一致，表明目的蛋白成功表达。纯化的VP1蛋白纯度为90％，浓度为70μg/ml。　　(4)用纯化的VP1蛋白作为包被抗原，建立ELISPOT检测方法，优化后的实验方案为:蛋白包被浓度为20μg/ml，细胞浓度为5×106/ml，HRP标记抗体稀释度为1∶10000。　　(5) ELISPOT结果提示，EV71感染者外周血抗VP1抗体分泌细胞明显增加。ELISPOT敏感性为90.0％，特异性96.7％。与ELISA检测抗EV71抗体方法比较，ELISPOT优于ELISA。　　结论:用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功表达了EV71 VP1蛋白，以VP1蛋白作为包被抗原建立ELISPOT方法检测EV71感染患者外周血特异性抗体分泌细胞，有较高的特异性和灵敏度，有望成为诊断EV71感染的一种理想方法。