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目的:观察豚鼠脂肪间充质干细胞(ADSCs)与β-磷酸三钙(β-TCP)材料体外复合培养的结合程度,并分析其构建组织工程人工听骨的可行性。 方法:(1)采用细胞差速贴壁法分离培养、纯化豚鼠 ADSCs,使用流式细胞仪检测 CD29、CD45、CD44进行间充质干细胞表面标记物鉴定。采用将第三代的ADSCs分别向成骨、成脂肪、成神经方向诱导分化;倒置显微镜下观察细胞形态学变化,诱导后进行成骨、成脂肪、成神经特异鉴定,检测其多向分化能力。(2)将豚鼠ADSCs与β-TCP共培养7天,电镜观察体外培养的ADSCs与此种支架材料的复合情况;(3)将用Brdu标记后的豚鼠ADSCs与β-TCP复合培养7天后植入豚鼠听泡模型,在12周取出组织工程人工听骨进行病理学观察及扫描电镜观察材料的成骨能力。 结果:(1)细胞培养的检测:①ADSCs的检测:第三代的ADSCs形态均一,呈单层生长,细胞多为长梭形,呈旋涡状排列;其表面标记物CD29、CD44和CD45表达分别为86.3%、55.5%、0.4%;②多向分化检测:成骨诱导后倒置显微镜下可见细胞具有成骨细胞形态特征;茜素红染色细胞间可见红染的钙结节,von-Kossa染色后可见大片棕褐色颗粒,碱性磷酸酶染液检测染色后可见大片蓝紫色颗粒。成脂诱导可见脂质滴的数量逐渐增多,油红O染色可见脂质滴被染成红色。成神经细胞诱导可见细胞慢慢聚成团状,悬浮在培养液中,分裂增殖明显迅速形成团状的类神经球,贴壁后免疫荧光染色nestin阳性和GFAP阳性。此后更换为成神经分化培养液,部分细胞胞体稍有回缩,并伸出少量细长突起,呈现类神经元样改变,这些细胞少部分为NF200阳性表达。(2)体外复合培养7天后,电镜下可见ADSCs贴附在材料表层,形态稳定,生长旺盛,增殖力强,具有极佳的延伸性(3)回植后的组织工程人工12周HE染色后骨板间发现骨组织特异性的结构-骨陷窝,其内有骨细胞,无巨噬细胞和多核巨细胞存在,证明了组织工程人工听骨已在体内向成骨方向转化,且与周围组织具有良好的生物相容性。免疫荧光染色的结果,证明生成的骨组织来源于标记的ADSCs。听骨扫描电镜观察到细胞扁平密集分布附着于材料孔隙和表面,与β-TCP结合紧密,实验组细胞数目明显高于对照组细胞数量,证明了组织工程人工听骨用作听骨赘复物更有优势。 结论:豚鼠ADSCs是一种适用于耳科实验研究的理想干细胞,而Β-磷酸三钙为优良的骨组织工程材料利于细胞黏附、增殖,可结合大量的ADSCs,可用于构建组织工程人工听骨替代听骨赘复物。