第一部分：Fas siRNA的设计、合成与筛选按sirNA的设计原则，设计和化学合成3个针对大鼠Fas的siRNA，对大鼠正常肝细胞(BRL细胞)传代养后，转染Fas siRNA，筛选高效抑制Fas表达的siRNA。 材料与方法：在Genebank中查找大鼠Fas mRNA序列((3enBank Accession No．NM139194)，应用Ambion公司的设计软件，设计针对Fas mRNA的3对Fas siRNA序列： Fas siRNA1：175位点，正义链：5’GACAACAACUGCAGAA dAdC3，反义链：3’dCdA GCUGUUGUUGAGAGUCUU 5； Fas siRNA2：315位点，正义链：5’ACACGGACAGGAAACACUA dGdT 3反义链：3’dTdG UGUGCCUGUCCUUUGUGAU 5： Fas siRNA3：481位点，正义链：5CACCUCGUGUGGACUUGAA dTdG 3．反义链：3dGdT GUGGAGCACACCUGAACUU 5。 同时合成阴性对照siRNA：正义链：5UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT3；反义链3dTdT AAGAGGCUUGCACAGUGCA 5。 化学合成方法生产Fas siRNAs。 取液氮保存之大鼠BRL细胞株，传代培养后用于转染。 试验分组：①空白对照组；②siRNA阴性对照组；③Fas siRNA 1组：④FassiRNA 2组；⑤Fas siRNA 3组。 3对Fas siRNA分别按50nmol/L的浓度转染BRL细胞，作为Fas siRNA组，以阴性siRNA转染细胞作为siRNA阴性对照组，非转染细胞作为空白对照组。转染前细胞培养基更换为Opti-MEM，在30 μl Opti-MEM中稀释siRNA，50μlOpti-MEM中加入2μl Lipofectamine2000混合，将稀释的siRNA与稀释的lipofectamine2000混合，室温培养20min，然后将siRNA和Lipofectamine2000的混合液加入细胞培养孔中，摇晃孔板使充分混合。孵育48h后收集细胞，RT-PCR检测Fas mRNA，Western blot检测Fas蛋白。 采用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法，对Fas mRNA进行相对定量检测。使用管家基因GAPDH作为内参，每一样本的Fas mRNA相对量除以GAPDH的相对量，即标准化，然后再用标准化值比较Fas mRNA在各样本中转录水平的差异。Western blot检测各转染细胞Fas蛋白水平，同时检测β-actin蛋白，作为内参较正Fas蛋白定量。 数据处理：计量资料采用均数4-标准差(x±s)，进行单因素方差分析或予以一般统计学描述。数据统计使用spss10.0软件包，α设定为0.05。 本实验共合成3对siRNA，转染BRL细胞48h后，抽提总RNA进行RT-PCR检测Fas mRNA。3对siRNA均发挥了不同程度的干预效应(P<0.01)，干预效果由强至弱为：Fas siRNA2>Fas siRNA1>Fas siRNA3，Fas mRNA相对表达量(Fas/GAPDH)分别低于空白对照组(69.3±7.8)﹪、(53.5±9.0)﹪和(45.0±8.9)﹪(P均<0.01)，以Fas siRNA2抑制效率最高。而阴性对照siRNA无干预作用，与空白对照组相比无统计学差异(P>0.05)。 Westem blot结果经计算机灰度扫描并与内参照(β-actin)比较分析显示：转染Fas siRNA后灰度比明显减低，Fas蛋白表达量分别低于空白对照(50±5)﹪、(75±7)﹪和(57±9)﹪(P均<0.01)，表明在蛋白水平Fas siRNA能显著抑制Fas基因表达，蛋白表达变化与mRNA改变基本一致，Fas siRNA2抑制效率最高。而siRNA阴性对照和空白对照相比无明显蛋白表达改变。 第二部分：本实验观察冷保存大鼠肝脏随时程延长细胞凋亡及Fas基因表达在冷灌注保存肝脏组织中的变化，并探讨通过水压注射法转染Fas siRNA对Fas基因表达进行抑制，能否减少冷灌注保存大鼠肝脏组织中的细胞凋亡。 材料与方法： 1、试验对象：16周龄SD大鼠54只，体重200-250g，均为雄性。 2、水压注射法转染siRNA：每组大鼠18只，10﹪水合氯醛腹腔注射麻醉，经阴茎静脉按实验分组注入配制好的实验药物，注射时间控制在15秒左右。实验分组：Fas siRNA组：注入200nmol/kg的Fas-siRNA(配入10﹪体重的磷酸盐缓冲液(PBS)内)；siRNA阴性对照组：注入200nmol/kg的阴性对照siRNA(配入10﹪体重的PBS内)。空白对照组：18只；仅注射10﹪体重的PBS。 3、大鼠供肝获取：转染后48h，大鼠在乙醚麻醉下经腹主动脉进行肝脏冷灌注取肝。 4、标本采集：冷保存2、4、6h后每组取6只供肝，取肝中叶进行相关检测。 5、检测内容：组织切片HE染色检查、Fas免疫组化检查、TUNEL染色检测细胞凋亡、电镜检查，提取肝组织RNA行RT-PCR检测Fas mRNA；组织匀浆抽提蛋白Western blot检测Fas蛋白。 6、数据处理：计量资料采用均数士标准差(x±s)，采用方差分析，P<0.05时有显著性差别。 结果： 1、所有大鼠都能安全接受水压注射法转染Fas siRNA。 2、TUNEL法检测冷保存大鼠肝组织肝脏组织中细胞凋亡，空白对照组的凋亡指数分别为2.40±0.29﹪、2.65±0.20﹪、6.65±0.38﹪，阴性siRNA对照组分别为2.25±0.31﹪、2.82±0.10﹪、7.60±0.29﹪。在2h、4h时，同组不同保存时间肝脏组织中凋亡细胞计数无显著性差异，但当保存时间到6h时凋亡细胞增多(P<0.01)。Fas siRNA组各时点凋亡计数分别为2.27±0.22﹪、1.88±0.14﹪、1.97±0.15﹪，各时点差别不明显，2h、4h时与对照组相比无明显差别，但6h时明显低于对照组(P<0.01)。电镜检测、HE染色检查发现Fas siRNA组的损伤较轻，细胞凋亡少。 3、在空白对照组和siRNA阴性对照组中，RT-PCR检测2h、4hFas mRNA表达量无明显差别，组间差别也不明显，此时Fas siRNA组的表达量明显较对照组低(P<0.01)；6h两组对照组的。Fas mRNA表达量明显增高(P<0.01)，组间差别不明显，而Fas siRNA组的Fas mRNA表达量仍无明显增高，与对照组问的差别更明显(P<0.01)。 4、在空白对照组和siRNA阴性对照组中，2、4h Fas蛋白量无明显差别，组间差别不明显，但Fas siRNA组的Fas蛋白量明显较对照组低(P<0.01)；6h两组对照组的Fas蛋白水平增高，组问差别不明显，而Fas siRNA组的Fas蛋白水平仍无明显增高，与两组对照组间的差别更明显(P<0.01)。在免疫组化检测也可见到Fas蛋白被Fas siRNA明显下调。 第三部分：本试验建立大鼠肝移植模型，探讨针对大鼠Fas基因的siRNA，能否通过抑制Fas基因，减少肝移植缺血再灌注时的细胞凋亡，达到保护供肝的作用。 材料与方法：实验动物：雄性SD大鼠150只，体重200-250g，分为三组，每组25对雄性SD大鼠。Fas siRNA组：供体大鼠经阴茎静脉注入200nmol/kg的Fas-siRNA(配入10﹪体重的PBS内)。siRNA对照组：供体大鼠经阴茎静脉注入200nmol/kg的阴性对照siRNA(配入10﹪体重的PBS内)。空白对照组：供体大鼠经阴茎静脉仅注射10﹪体重的PBS。转染试验后48h，将供体取肝进行原位肝移植手术。 肝脏复流后1、3、6、12、24h每组处死5只受体大鼠取材，经下腔静脉取血2 ml，送检AST、ALT，作为肝细胞保存再灌注损伤的指标。 取肝中叶，其右半部分于-80℃保存备用，行RT-PCR检测Fas mRNA、Western blot检测Fas蛋白；部分行HE染色、TUNEL染色、免疫组织化学染色检测、电镜检测。 数据处理：实验数据以x±s表示，使用SPSS 10.0对实验数据进行单因素方差分析。结果对照组与siRNA组肝移植再灌注后血清ALT、AST水平都逐渐升高，6h达到高峰，随后逐渐下降。各时点siRNA组的血清ALT、AST水平明显低于对照组。 TUNEL法和透视电镜检测细胞凋亡，可见在各时点所取的大鼠肝脏组织标一VII—本中，均有细胞凋亡发生。凋亡指数在再灌注6h达到高峰，Fas siRNA组的凋亡指数明显较对照组低。随I/R损伤加重，Fas免疫组化阳性细胞由散在变为成片染色，Fas siRNA组的染色阳性细胞数在各时点均较对照组少。