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植物在抵御外界胁迫的过程中，进化出了一套错综复杂的信号调控机制。促丝裂原活化蛋白激酶信号级联途径就是这些精细复杂的调控机制中的重要一种，在参与调节细胞分裂、分化、响应生物和非生物胁迫以及细胞程序性死亡等生命活动中发挥着十分重要的功能。该途径包含了MAPKs，MAPKKs和MAPKKKs三个家族的蛋白激酶，目前对于其中的MAPK家族和MAPKK家族的蛋白激酶研究的比较多，而MAPKKK作为MAPK级联途径的顶端组分的研究却很少，尤其是对其中的Raf亚族的研究更加罕见。在报道的研究中，对于MAPKKK家族基因的研究大多集中在拟南芥、水稻和玉米等植物中，在重要的经济作物棉花中的研究却十分少见。 本研究以陆地棉（Gossypium hirsutum L.）（鲁棉22）为实验材料，采用了同源克隆的方法克隆获得两个棉花MAPKKK基因，分别命名为GhMAPKKK49和GhMAPKKK65。通过序列分析和进化树分析发现，GhMAPKKK49和GhMAPKKK65都与其他物种的Raf亚族的MAPKKK基因推导的氨基酸序列具有较高的同源性，因此GhMAPKKK49和GhMAPKKK65都属于MAPKKK中的Raf亚族。进一步通过对这两个基因表达模式分析和生物学功能鉴定等研究，得到以下实验结果: (1)采用荧光定量PCR的方法对GhMAPKKK49基因在棉花受到多种外界胁迫时的表达特性分别进行了研究。研究结果表明，GhMAPKKK49基因的转录水平受到干旱(15％PEG6000)、高盐(NaCl)、机械损伤(Wounding)和多种信号分子(ABA，SA，MeJA，ET，GA3，6-BA，NAA，H2O2)等因素的诱导。同时，GhMAPKKK49基因的表达受到一些生物胁迫，青枯菌（Ralstonia solanacearum/R.solanacearum）和立枯丝核菌（Rhizoctonia solani/R.solani）的抑制。因此GhMAPKKK49可能介导多种生物及非生物胁迫过程并参与多种复杂的信号分子途径。 通过酵母双杂交实验证实GhMAPKKK49与GhMKK4和GhMKK9分别互作，而不与GhMKK5或GhMKK6互作。说明GhMAPKKK49为GhMKK4和GhMKK9的上游激活基因。 (2)对GhMAPKKK65基因的启动子序列进行分析，发现一系列的与胁迫、生长发育、光响应和激素响应等相关的顺式作用元件位于GhMAPKKK65基因的启动子中。同时，对GhMAPKKK65基因在棉花受到外界胁迫时的表达模式分析发现，该基因受到青枯菌、立枯丝核菌、干旱、低温、机械损伤和多种信号分子(6-BA、GA3、ET、SA、MEJA)的诱导。因此，GhMAPKKK65可能介导多种生物及非生物胁迫过程并参与多种复杂的信号分子途径。 构建GhMAPKKK65基因的正义植物过表达载体，利用农杆菌侵染的方法获得GhMAPKKK65基因超表达本生烟植株后并进行生物学分析，结果表明，GhMAPKKK65基因超表达植株对青枯病原菌和立枯病原菌敏感性增强，并且表现出ROS积累和部分抗氧化酶活性相对较低。因此，GhMAPKKK65基因可能响应植物抵御病原菌信号途径。 酵母双杂交实验表明，GhMAPKKK65并不与GhMKK4或GhMKK5或GhMKK6或GhMKK9中的任何一个互作，可能参与了其他MAPK信号通路的响应植物抵御病原菌信号的过程。