口蹄疫(FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起猪、牛、羊等偶蹄兽的一种急性热性高度接触性传染病，严重危害家畜的生产力和畜产品质量安全，被OIE列为烈性传染病。我国目前通过接种合成肽疫苗和灭活苗的方法来控制该病的流行，合成肽苗虽然具有良好的保护效果，但生产工艺复杂，成本高不利于普及推广。因而一种廉价、安全、高效的疫苗生产系统的开发具有巨大的应用前景，本文所运用的毕赤酵母表达系统是目前较适宜的一种方法。 根据已知载体基因序列，设计含有XhoⅠ和XbaⅠ酶切位点的一对引物，采取聚合酶链式反应(PCR)法，以质粒pMD18-P1为模板进行了VP1的扩增。PCR产物经纯化回收后，克隆到pMD18—Simple T载体上，经序列测定证实VP1基因克隆到T载体上。将克隆质粒pMD18—VP1、pPICZα C和pGAPZα A质粒分别用XhoⅠ和XbaⅠ双酶切，然后连接，转化大肠杆菌，得到重组表达质粒pPICZα C—VP1、pGAPZα A—VP1。经酶切和测序鉴定，VP1基因片段插入到表达载体pPICZα C和pGAPZαA启动子下，并形成正确的开放阅读框(ORF)。 用SacⅠ单酶切pPIcZα C—VP1，电击转化感受态的毕赤酵母工程菌X—33，最后涂布YPDS+ZeocinTM选择性培养基，置30℃温箱培养3～5天，结果获得多个单菌落。通过提高抗生素浓度，筛选出高抗性的转化子。先用BMGY培养基激活培养，离心后用BMMY培养基重悬菌体。每24小时添加一次甲醇，保持其终浓度为1.0％，诱导表达96小时后，收集菌液。取少量上清液进行SDS-PAGE电泳分析和Western—Blot鉴定。 将重组质粒pGAPZα A—VP1经限制性内切酶AvrⅡ线性化，用电转化的方法导入Pichia．pastoris X—33中，整合到毕赤酵母染色体的高效启动子3磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的下游。用高浓度的Zeocin抗生素筛选高拷贝转化子，将重组菌株接种于YPD培养基诱导表达，筛选菌株后进行大规模培养，通过收集不同时间段的表达产物，进行SDS-PAGE分析表明，培养72h后目的蛋白表达量最大，达110.537mg/L，表达蛋白的理论分子量为45KDa。对纯化后的蛋白进行了生物活性测定，表达的VP1蛋白生物学活性良好。 将pPICZα C—VP1重组酵母所表达的蛋白制成油乳剂疫苗，经皮下多点注射免疫小鼠。ELISA试剂盒检测小鼠血清中FMDV特异抗体变化。结果发现，自制油乳剂疫苗能诱发小鼠的体液免疫反应。 综上所述，本研究成功地在毕赤酵母中分泌表达出FMDV VP1结构蛋白，该蛋白所制成的亚单位疫苗能够刺激小鼠产生抗体，为口蹄疫新型疫苗的研究奠定了基础。